SP及VIP
便秘实验方案
1.VIP. SP检测
（1）原理  神经肽在便秘的发生过程中具有重要作用[1-3]。胃肠肽由胃肠神经分泌释放，而肠神经广泛存在于肠道薪膜层、薪膜下层、肌层.神经肤是主要起传递信息作用的生物活性多肤，扮演着神经激素、神经递质、神经调质和细胞因子等多种角，是调节胃肠功能的重要因素.一般来讲，薪膜下神经丛主要参与肠道分泌和吸收功能，而肌间神经丛主要参与肠道运动功能的调节[4].目前已确认的肠神经递质或调质多达数10种，其中兴奋性递质主要包括SP、乙酞胆碱等;抑制性递质包括VIP)、NO、三磷酸腺苷(ATp)等.
小鼠结肠P物质(substance  P, S P)是由胃肠道固有神经或外来神经释放，存在于胃肠道薪膜神经丛、肌间神经丛，是调节肠道作用最强的兴奋性肤能神经递质，能抑制肠道豁膜分泌，刺激肠道运动，可直接作用大肠纵行肌环行肌引起收缩，增加结肠收缩和运动[4]，SP可引起大鼠食道平滑肌收缩,促进食物下移。其增高可有效促进胃肠运动,国内外学者对慢性传输型便秘患者结肠进行研究后认为慢性传输型便秘的产生可能与结肠肌间神经丛内SP含量减少有关[5-9]，可能是导致结肠传输功能减弱的原因之一
VIP,血管活性肠肽(vasoactive intestinal polypeptide, VIP)能神经按神经元功能不同分为运动神经元和分泌神经元.前者其传出主要使胃肠括约肌舒张，后者则主要刺激肠液分泌[l0]，VIP是由28个氨基酸组成的肽类,是抑制性神经元的非肾上腺素能、非胆碱能递质。它使结肠运动减弱sp文,舒张肠管,参与水及电解质的吸收。长期便秘患者远端结肠的VIP神经成分减少或缺失,肌层中的VIP含量少于正常。VIP可以使结肠运动减弱.尽管VIP能神经是胃肠道运动的抑制性神经，但国内外大量学者通过对慢性便秘患者及慢性传输型便秘大鼠结肠VIP能神经进行免疫组化研究认为，其结肠肌层内VIP能神经呈减少趋势[11]，并认为VIP是产生下行性抑制的重要因素，其含量降低可能导致肠神经系统传输障碍，产生传输减慢[12].同时由于VIP浓度降低可能引起结肠出现过度的阶段性蠕动，使有效推动减弱[13-16].
【参考文献】
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附：方法:剪取小鼠近端结肠2 cm，纵行剖开，NaCI(含Na 9 glL)漂洗后，固定于40叭中性甲醛溶液中，常规脱水、石蜡包埋，常规切片机切片，厚约4 }m.分别进行HE染和免疫组化染.采用Envision免疫组化染法(两步法)，光学显微镜下，采用中文IMS细胞图像分析系统，每张片随机取3个视野，对SP,VIP含量进行定量分析，并对免疫组化指数进行统计.另可测大鼠VIP.SP
（2）方法 ① 结肠肌间神经丛标本制作  大鼠禁食12 h,3%钠麻醉后,通过腹部正中切口暴露腹腔,切取整段结肠。结肠取材后用0.01 .mol/L磷酸缓冲液(PBS)(pH7.4)冲洗。以4%的多聚甲醛充盈到合适程度后将结肠两端扎紧,立即放入4%多聚甲醛液中固定6~8 h(4℃),再移入30%蔗糖液中(4℃)过夜。然后将固定好的结肠取出,用0.01 mol/L PBS漂洗三次,再将
肠管剪成长约1 cm的小段,将一粗细合适的玻璃棒插入肠管,然后用镊子在肠系膜附着处沿肠管纵轴划痕,用镊尖沿划痕轻轻剥离纵肌层,制作肌间神经丛铺片标本,将铺片标本收集在0.01 mol/L PBS中保存(4℃)。
　②免疫组化染  将制备好的结肠肌间神经丛铺片标本用0.01 mol/L PBS充分漂洗,置入0.3%过氧化氢(37℃)孵育30 min,去除内源性过氧化物酶活性,0.01
mol/L PBS漂洗3×5 min;然后在10%正常山羊血清中孵育30 min(37℃),滴加一抗(1∶50),先孵育(37℃)3 h,然后在4℃冰箱内过夜,0.01 mol/L PBS漂洗3×5 min;生物素标记的二抗孵育(37℃)2 h,0.01 mol/L PBS漂洗3×5min;辣根酶标记链霉卵白素孵育(37℃)1 h,0.01 mol/LPBS漂洗3×5 min;DAB显3~5 min,自来水冲洗,贴片、晾干、脱水、透明、DPX封片。对照实验:用羊血清替代一抗。
③染结果判断  使用德国Leica公司生产的QWin图像处理及分析系统对染结果进行分析。于40倍光镜下每张铺片随机选取3~5个视野,图像经摄像机摄入后存入计算机内,进行彩值分割参数估计,计算阳性神经的平均面密度。面密度是指目标面积占统计场面积的百分比,反映阳性神经在铺片标本中的含量.
2.血红素氧合酶2
（1）目的：内源性一氧化碳(CO)是肠道非肾上腺素非胆碱能神经(NANC)分泌的抑制性神经递质，对调节胃肠运动有重要作用。血红素氧合酶(Ho)是co合成的关键酶，有三种同工酶，即诱导型HO(HO-l)，原生型HO(Ho-2)和Ho-3 (不产生co，功能尚不清楚).其中HO-2则主要分布于脑和胃肠道平滑肌[8]，胃肠道的Ho-2主要分布于肠道粘膜下神经丛与肌间神经从，应激能提高HO-2活性.CO和No在人体某些功能中的作用较相似，是重要的化学信号物质，调节神经递质传导、平滑肌的紧张性及其对细胞损伤反应，并在细胞功能和信息联络发挥重要
（2）方法: 将48只小鼠随机分为实验组A，实验组B和对照组（N=16).实验组A和B分别2.5mg/(kg·d)和3.5mg/( kg·d)，对照组以等量生理盐水，处理45d.各组随机处死小鼠一半(为实验组Al、Bl及对照组1).其余小鼠继续饲养并停药观察15d(实验组AZ、BZ及对照组2).第60天处死全部小鼠，处死前予炭末推进法评价结肠传输运动功能符合结肠慢传输运动小鼠模型，取各组小鼠近端及远端结肠组织各0.5cm.小鼠粪便性状采用Bristol分级.
.2免疫组织化学检测HO-2表达:HO-2一抗及免疫组化试剂盒均购自Promega公司，二抗(羊抗兔抗体，工作液浓度)购自北京中山生物科技公司，按说明书进行常规免疫组化检测，PBS代
替一抗作为阴性对照.阳性结果判断:胞质染呈棕者判定为阳性细胞.
（3）免疫组化结果分析：结肠孰膜下神经丛与肌间神经丛可见丰富的深棕颗粒，即HO一2阳性神经纤维，环肌和纵肌内HO一2阳性细胞较乳膜下、肌间层明显减少.各实验组阳性细胞较对照组明显减少;大剂量处理的实验组比小剂量组阳性细胞明显少;第60天时各实验组较第45天时各实验组HO一2阳性细胞的表达减少(图l).

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