重庆医科大学
研究生学位论文独创性声明
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学位论文作者签名王跫锰日期：塑蔓鑫￡亟！蛰
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论文作者签名：芏墨璧亟
指导教师签名
日期
重庆医科大学博士研究生学位论文
英文缩写ＡＫ
Ａｍｐ
ＡＰＳ
Ｂｌａ
ｂｐ
ＣＤ
ＡＺ
ＣＬＡ
ＣＩＰ
ＣＰＳ
ＣＲＯ
ＣＴＸ
ＣＦＵ
ｄｄＨ２０
ＤＭＳＯｄ》ｎＰ
ＤＴＴ
ＥＤＴＡ
ＥＳＢＬｓ
ＧＭ
ＩＰＭ
ＩＰＴＧ
符号说明
英文全称
ａｍｉｋａｃｉｎ
ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ
ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ
ａｍｍｏｎｉｕｍｐｅｒｓｕｌｆａｔｅ
Ｂｉｓ—ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ
ｂａｓｅｐａｉｒ（ｓ）
ＣｉｒｅｔｄａｒＤｉｃｈｒｏｉｓｍ
Ｃｅｆｔａｚｉｄｉｍｅ
ｅｌａｖｕｌａｎｉｅａｃｉｄ
ｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｅｉｎ
ｅｅｆｏｐｅｒａｚｏｎｅ／ｓｕｌｂａｃｔａｍ
ｃｅｆｌａ＇ｉａｘｏｎｅ
ｃｅｆｏｔａｘｉｍｅ
ｃｏｌｏｎｙｆｏｒｍｉｎｇｕｎｉｔ
ｄｏｕｂｌｅｄｉｓｔｉｌｌｅｄｗａｔｅｒ
ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ
ｄｅｏｘｙＴｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ
ＥｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃａｃｉｄＥｘｔｅｎｄｅｄ—ｓｐｅｃｔｒｕｍ１３·－ｌａｃｔａｍａｓｅｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ
ｉｍｉｐｅｎｅｍ
ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｔｈｉｏ一０一Ｄ－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ
ＭＡＲｍｕｌｔｉｐｌｅａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ
中文译名
阿米卡星
氨苄西林
丙烯酰胺
过硫酸铵
双丙烯酰胺
Ｂ～内酰胺编码基因
碱基对
圆二二散
头孢他啶
克拉维酸
环丙沙星
头孢哌酮／舒巴坦
头孢曲松
头孢噻肟
菌落形形成单位
双蒸水
二甲亚砜
脱氧核糖核苷三磷酸
二硫苏糖醇
乙二胺四乙酸
超广谱Ｂ一内酰胺酶sp文
庆大霉素
亚胺培南
异丙基硫代Ｂ旷半乳糖苷
多重抗生素耐药性
重庆医科大学博士研究生学位论文
ＭＢＬ
２一ＭＰＡ
ＭＩＣ
ＮＴＣ
ＰＣＲ
ｐＨ
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ＳＤＳ
Ｔａｑ
ＴＡＥ
ＴＥ
ＴＥ眦Ｄ
髓ｓ
Ｔｄｓ，ＨＣｌ
ＺｎＣｌ２
ＭＳ
ＭＡＬＤＩ．ＴＯＦ
ＦＩｍｅｔａｌｌｏ口一ｌａｃｔａｒｎａｓｅ
２－ｍｅｒｃａｐｔｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃａｃｉｄ
ｍｉｎｉｍａｌｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ｎｉｔｒｏｃｅｆｉｎ
ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ
ｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆｈｙｄｒｏｇｅｎ
ｃｅｆｅｐｉｍｅ
ｒｉｍｓｐｅｒｍｉｎｕｔｅ
ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ
ｔｈｅｒｍｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）
腽Ｓ—ａｃｅｔａｔｅａｃｉｄ—ＥＤＴＡ
吲Ｓ．ＥＤＴＡ
Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌｅｎｅ
Ｄｉａｍｉｎｅ，
Ｔｒｉｓ；（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ
ＴｒｉｓｈｙｄｒｏｃＭｏｒｉｄｅ
ｅｈｌｏｒｉｄｅＺｉｎｃ
ＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ
ＭａｔｒｉｘａｓｓｉｓｔｅｄｌａｓｅｒＤｅｓｏｒｐｔｉｏｎ
Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ·ＴｉｍｅＯｆＦｌｉｇｈｔ
ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＩｎｔｅｎｓｉｔｙ
金属Ｂ一内酰胺酶
２一巯基丙酸
最低抑菌浓度
头孢硝噻吩
聚合酶链式反应
ｐＨ值
头孢吡肟
聩ｆ分
十二烷基硫酸钠
栖热水生菌ＤＮＡ聚合酶
ＴｒｉＳ－乙酸一ＥＤＴＡ
三（羟甲基）氨基甲烷～
乙二胺四乙酸
Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’一四甲基
乙二胺
三（羟甲基）氨基甲烷
Ｔｒｉｓ盐酸
氯化锌
质谱
基质辅助激光解吸电离
飞行时间
荧光强度
刖置
人类自１９４０年中期大量生产抗生素以来，随着广谱抗菌素在临床上广泛应用，细菌通过不断进化获得耐药性，产生了许多耐药菌株，据全国耐药监测机构报道，耐药菌引起的医院感染人数己占到住院感染患者总人数的３０％，其中Ｂ一内酰胺酶产生菌占２５％－３５％。Ｂｕｓｈ将该酶分为四类：Ａ、Ｂ、ｃ和Ｄ。Ａ、Ｃ、Ｄ类Ｂ内酰胺酶活性部位有一个丝氨酸残基，因而被称为丝氨酸一内酰胺酶，Ｂ类０一内酰胺酶是一组活性部位为金属离子且必须依赖少数金属离子（主要为ｚｎ”）的存在而发挥催化活性的酶类，所以被称为金属１３一内酰胺酶（ｍｅｔａｌｌｏ—Ｂ．１ａｃｔａｍａｓｅｓ，ＭＢＬＳ）。其底物涵盖碳青霉烯类在内多种８一内酰胺类抗生素，而且临床上使用的Ｂ一内酰胺酶抑制剂如克拉维酸等不能抑制其活性。ＩＭＰ一１是金属Ｂ一内酰胺酶研究热点，其金属酶编码基因可借助整合子的移动，基因盒的嵌入、切除，导致细菌间耐药性呈水平传播，给临床抗菌带来严峻挑战。目前对ＩＭＰ一１酶的酶学和分子生物学特性有所认识，对其与抑制剂ＥＤＴＡ和巯基抑制剂ＤａｎｓｙｌＣｎＳＨ抑制反应机理，动力学特性及活性中心锌离子的功能和锌离子上方氨基酸功能尚缺乏研究，而
国内有关ＩＭＰ—ｔ研究甚少报道。
本课题建立了金属Ｂ一内酰氨酶（ＩＭＰ—１）的表达、纯化、鉴定方法；并研究ＩＭＰ一１与抑制剂ＥＤＴＡ相互作用机理，测定其去活化反应动力学参数：合成了新的抑制剂和荧光试剂ＤａｎｓｙｌＣｎＳＨ，并研究与ＩＭＰ一１相互作用时荧光性质的改变，抑制反应机理及过程和荧光探针检测方法；同时构建了ＩＭＰ一１的突变体，从基因和蛋白水平研究其功能及酶的活性。以上研究为开发用于临床上金属Ｂ一内酰胺酶抑制剂提供了新的实验依据。
本研究受到日本政府贷款《重庆市高等教育项目》资助
摘要
目的：建立ｐＥＴ９ａ／ｄ．ＩＭＰ。ｌ在Ｅ·ｃｏｌｉＢＬ２１中表达，纯化方法，并得到高纯度的金属Ｂ一内酰胺酶（ＩＭＰ．１）；研究ＩＭＰ．１与抑制剂ＥＤＴＡ相互作用机理并测定其动力学参数；合成新的巯基抑制剂ＤａｎｓｙｌＣｎＳＨ，探讨其与ＩＭＰ一１相互作用机理和荧光性质的改变，以及用ＤａｎｓｙｌＣ２ＳＨ作荧光探针检测ＩＭＰ—ｌ；构建ＩＭＰ．１的突变体并在Ｅ＇ｃｏｌｉＪＭｌ０９中表达，纯化，研究ＩＭＰ一１突变体与底物相互作用动力学参数，并探讨其功能。
方法：将ｐＥＴ９ａ／ｄ．ＩＭＰ．１质粒转化到Ｅ·ｃｏｌｉＢＬ２１细菌中，大景表达后，超声裂解，
裂解液经ＳＰ。ＳｅｐｈａｒｏｓｅＣｏｌｕｍｎ和ＳＰ。Ｇ７５Ｃｏｌｕｍｎ纯化，所得产物用ＳＤＳ—ＰＡＧＥ鉴定，并用ＭＡＬＤＩ．ＴＯＦ．ＭＳ测定其分子量和纯度；用头孢噻啶Ｃｅｐｈａｌｏｒｉｄｉｎｅ作底物，研究不同ｐＨ值和温度下，ＥＤＴＡ使ＩＭＰ．１去活性过程，酶催化反应速度并用Ａｒｒｈｅｎｉｕｓ方程式计算活化能Ｅａ和熵变△ｓ；化学合成新的巯基抑制剂ＤａｎｓｙｌＣｎＳＨ，探讨该抑制剂与金属１３一内酰胺酶相互作用时荧光性质的改变并测定其解离常数ＫＤ，荧光强度ＦＩ与ＩＭＰ一１浓度关系曲线，用头孢哨噻吩Ｎｉｔｒｏｃｅｆｍ作底物，测定用ＤａｎｓｙｌＣｎＳＨ作抑制剂时ＩＭＰ—ｌ和ＩＭＰ．１Ｗ２８Ａ与底物相互作用的水解曲线，并由酶催化反应速度，计算抑制常数Ｋｉ，同时用ＤａｎｓｙｌＣ２ＳＨ作荧光探计测定细胞培养液和租提物中ＩＭＰ。１浓度；设计ＩＭＰ一１点突变引物，以ｐＫＦｌ８Ｍ—ＩＭＰ一１质粒ＤＮＡ为模板进行ＬＡ．ＰＣＲ，产物经纯化后测定其序列并转化到Ｅ＂ｃｏｌｉＪＭｌ０９中表达，并经谱柱纯化后得到突变体Ｖ２５Ａ，Ｖ２５Ｉ，Ｖ２５Ｇ，测定不同突变体与底物相互作用动力学参数和ＣＤ图，研究ｐＨ值对不同突变体酶催化反应的反应速度的影响。
结果：金属Ｂ一内酰胺酶（ＩＭＰ．１）在Ｅ·ｃｏｌｉＢＬ２１中经表达后其
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