广东养殖牛蛙主要细菌病调查及耐药性分析
0  引言
牛蛙属两栖纲、无尾目、蛙科、蛙属，因其雄性叫
声宏亮而得名。牛蛙在自然条件下生长快、抗病力强，对环境的适应力强[1-2]，但是人工养殖密度高，养殖用
收稿日期：2023-04-21
基金项目：广东农技服务轻骑兵重大农业技术乡村行推广项目（XYL2022GZ196C08）；2021年广东省驻镇帮镇扶村农村科技特派员项目（KTP20210125）
作者简介：马杰（1997-），男，山西人，汉族，硕士在读，研究方向：水产动物病害防控。*通信作者简介：刘春（1982-），男，汉族，博士，副教授，研究方向：水产动物病害防控。
马杰，孙菁阳，林翰，等．广东养殖牛蛙主要细菌病调查及耐药性分析[J]．现代畜牧科技，2023，98（7）：7-12．　doi ：10. 19369/j.
cnki.2095-9737. 2023. 07. 002．　MA Jie ，SUN Jingyang ，LIN Han ，et al ．Epidemiological Investigation and Antimicrobial Susceptibility Analysis of Cultured Rana catesbeiana  in Guangdong Province[J]．Modern Animal Husbandry Science & Technology ，2023，98（7）：7-12.
广东养殖牛蛙主要细菌病调查及耐药性分析
马杰1，孙菁阳1，林翰1，陈克松1，李花1，王伟2，徐斌2，林蠡1，刘春1*
（1. 仲恺农业工程学院动物科技学院/广州市水产病害与水禽养殖重点实验室/仲恺农业工程学院健康养殖创新
研究院，广东 广州 510225；2. 广东海兴农集团有限公司，广东 广州 511400）
摘要：为了解广东养殖牛蛙病害流行情况，本研究于2020年11月—2022年10月对广州、汕头、惠州、清远等地养殖牛蛙进行病原检测及细菌病原的耐药试验。本次研究共采集样本62批，患病牛蛙351只，其中细菌感染245例、细菌病毒混合感染35例（未发现单一病毒感染的病例）、不明原因病例71例。分离细菌181株，主要包括伊丽莎白菌（22.65%）、气单胞菌（16.57%）等，分离的20株代表菌株耐药性分析显示多数感染菌株耐药性较强。本研究为厘清广东省养殖牛蛙病害流行情况提供基础数据，也为牛蛙疾病的防控和合理用药提供理论依据。关键词：牛蛙；流行病学调查；细菌检测；耐药分析
中图分类号：S947.2  　文献标识码：A  　doi：10.19369/jki.2095-9737.2023.07.002
Epidemiological Investigation and Antimicrobial Susceptibility Analysis of Cultured
Rana catesbeiana  in Guangdong Province
MA Jie 1，SUN Jingyang 1，LIN Han 1，CHEN Kesong 1，LI Hua 1，WANG Wei 2，XU Bin 2，LIN Li 1，LIU Chun 1*
（1. Guangzhou Key Laboratory of Aquatic Animal Diseases and Waterfowl Breeding ，Innovative Institute of Animal Healthy Breeding ，College of Animal Sciences and Technology ，Zhongkai University of Agriculture
and Engineering ，Guangzhou Guangdong 510225，China ；2. Guangdong Hisenor Group Co.，Ltd ，
Guangzhou Guangdong 511400，China ）
Abstract ：To determine the disease occurrence of cultured Rana catesbeiana  in Guangdong province ．This study conducted pathogen detection and drug resistance test of bacterial pathogens of bullfrogs in city of Guangzhou ，Shantou ，Huizhou and Qingyuan from November 2020 to October 2022．A total of 62 batches of samples were collected in this study ，including 351 diseased bullfrogs ．There are 245 bacterial infections cases ，35 cases of mixed bacterial and viral infections (no cases of single viral infection were found)，and 71 unknown causes in the diseased bullfrogs ．Furthermore ，181 strains of pathogenic bacteria were isolated and identification from diseased bullfrogs ，includin
g two main types ：Elizabethkingia spp ．（22.65%）and Aeromonas spp ．（16.57%）．The analysis of drug resistance of 20 isolates showed that most of the isolates had strong drug resistance ．This study provides basic data for clarifying the epidemic situation of cultured bullfrog diseases in Guangdong Province ，and also provides theoretical basis for prevention and control of bullfrog diseases ．
Keywords ：Rana catesbeiana ，epidemiological investigation ，bacterial detection ，drug resistance analysis
水污染严重，环境恶化引起牛蛙病害频繁发生[3-6]。虽然我国已有几十年的养殖历史，但是牛蛙的基础研究相对薄弱，病害研究较少，相关的研究主要集中在病原的分离鉴定方面，养殖牛蛙流行病学和系统性的致病机制研究较少。目前牛蛙报道的常见疾病主要有歪头病、白内障、腹水病、肚胀病等[7-11]，多数的疾病都以症状命名，且一些疾病报道有多种病原[12-17]，导致养殖过程中疾病诊断和防控困难。牛蛙养殖过程中抗生素普遍使用不规范，如一些养殖户定期使用抗生素预防疾病，发病后不进行病原菌药敏分析，盲目使用抗生素和水产违禁药物，滥用情况较严重[18]。目前研究发现牛蛙病原菌耐药性普遍较强，没有系统的流行病原菌株耐药情况的研究报道。为了解广东省养殖牛蛙病害流行情况，本研究于2020年11月—2022年10月开展广东省养殖牛蛙流行病学调查，对主要病害种类、发病特征、流行病原及耐药情况等进行调研与分析。
1  材料与方法
1.1  主要试剂和仪器
5%绵羊血琼脂平板购自广州环凯微生物有限公司；DNA Taq酶与DNA Marker为宝日医生物技术（北京）有限公司产品；组织DNA提取试剂盒为诺维赞生物科技股份有限公司；药敏纸片均购自于杭州天和微生物有限公司。PCR扩增仪（Eppendorf公司）。相关引物由广州天一辉远基因科技有限公司合成。
1.2  调查时间和取样方法
本研究于2020年11月—2022年10月在广东省广州、惠州、汕头等市的牛蛙养殖场开展牛蛙采样工作。采取临床症状明显的活体或濒临死亡的牛蛙，每个发病蛙池采样5只以上。
1.3  症状检测
对采集的病蛙进行症状检测，肉眼观察体表有无损伤，体是否变化，体形是否正常，器官组织是否有充血、出血、溃疡、发炎、肿胀和黏液增多等异常状况；显微镜检查异常部位是否有寄生虫或真菌等寄生。
1.4  细菌分离与鉴定
无菌条件下，取发病蛙肝、脾、肾、脑组织划线接种于5%绵羊血琼脂平板上，28 ℃恒温培养24～72 h后选取具有代表性的菌落纯化培养，纯化好的单菌落用于后续的分子鉴定和药敏试验。
菌株的鉴定采用PCR方法。以纯化后的细菌作为模板，采用16S rDNA通用引物TW6（5’-AGAGTTTGAT CCTGGTCAGAACGAACGCT-3’）、TW7（5’-TAC GGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3’）进行PCR 扩增，PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共32个循环；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。扩增产物送往广州天一辉远基因科技有限公司进行DNA测序，测序结果与GenBank 数据库中参考细菌序列核苷酸同源性分析后进行种类鉴定。
1.5  病毒的检测
目前文献已报道的感染牛蛙病毒主要为蛙虹彩病毒3型（FV3）[19-20]，因而本研究采用PCR方法对患病牛蛙进行蛙虹彩病毒的检测。病蛙肝、脾、肾、脑组织使用组织DNA提取试剂盒按照说明书提取，提取的组织基因组DNA保存于-20 ℃冰箱中备用。
P C R检测方法采用提取的组织D N A为模板，采用G e n B a n k数据库中的蛙虹彩病毒3型M C P（登录号U36913.1）基因序列设计特异性引物F V3F （5’-CTTCTCCAGAGACAGAGGC-3’）、FV3R （5’-GCAGGCTGAGGGCATAAG-3’）进行检测，PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，56
℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共32个循环；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。扩增产物送广州天一辉远基因科技有限公司测序，测序结果与GenBank数据库中参考病毒序列进行核苷酸同源性分析后进行种类鉴定。
1.6  耐药性试验
病原菌的耐药性实验采用药敏纸片扩散法在5%绵羊血琼脂平板上进行，28 ℃培养24 h后观察抑菌圈有无并测量直径。采用文献[21]的标准判定细菌的耐药性。
2  结果与分析
2.1  样本信息牛蛙养殖
本研究于2020年11月—2022年10月在广州、惠州、汕头、清远等地养殖场共进行牛蛙流行病学调查62批次，采集患病牛蛙样本351只，见表1。
表1  2020年11月—2022年10月广东省采集样本信息
采集地点采集次数（批次）样本数量（只）
广州市30167
惠州市1895
汕头市532
清远市427
其他530
总计62351
2.2  患病牛蛙临床症状
通过对采集牛蛙临床症状观察发现，病蛙主要表现出几种常见的症状，包括歪头（蛙头部向一侧倾斜，见图1A）、白眼（单侧或双侧眼球浑浊发白，见图1B）、腹胀（腹部膨胀，见图1C）、红腿（后肢皮肤充血发红，见图1D）、肠炎（肠壁充血发红，肠内无内容物，见图1E）、花肝（肝脏略有肿大，呈黄红相间的花斑肝，见图1F）。
图1  患病牛蛙常见临床症状
A ：头部出现向一侧严重倾斜；
B ：单侧或双侧眼球常浑浊发白、轻度突出；
C ：腹部膨胀；
D ：后肢皮肤充血发红；
E ：肠壁充血发红，肠内无内容物；
F ：肝脏略有肿大，呈黄红相间的花斑肝
2.3  病原检出统计
本次调查的病原检测结果，见图2。本研究共检测病蛙351例，其中细菌感染病例最多，为245例（占检测总量的69.8%）；细菌与病毒混合感染35例，未发现单一病毒感染的病例；不明原因疾病71例。细菌感染呈现多种病原菌混合感染的趋势；在细菌感染病例中，2种及2种以上的细菌混合感染206例，占细菌感染病例的84.08%；单种细菌感染39例，占细菌感染病例的15.92%。
图2  牛蛙感染类型统计
2.4  病原菌种类统计
本研究共分离到病原菌181株，主要有伊丽莎白菌（Elizabethkingia ）、链球菌（Streptococcus ）、气单胞菌（Aeromonas ）、爱德华氏菌（Edwardsiella ）、弧菌（Vibrio cholerae ）、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella
pneumoniae ）、不动杆菌（Acinetobacter ）。分离的
病原菌中，伊丽莎白菌株最多，有41株（占分离菌的22.65%），包括39株米尔伊丽莎白菌（Elizabethkingia
miricola ）和2株按蚊伊丽莎白菌（Elizabethkingia
anophelis ）；其次为气单胞菌，有30株（占分离菌
的16.57%），包括26株嗜水气单胞菌（Aeromonas
h y d r o p h i l a ）和4株维氏气单胞菌（A e r o m o n a s veronii ），见图3。
图3  菌株分离鉴定的相关信息
2.5  疾病种类分析
患病牛蛙的临床症状与病原检测结果统计，见表2。患病牛蛙病原感染具有典型特征，如米尔伊丽莎白菌感染会引起牛蛙歪头、白眼、后肢充血发红、腹胀、腹水；嗜水气单胞菌感染牛蛙会出现后肢充血发红、腹水等。不同病原混合感染牛蛙除出现病原单独感染的症状外，还有可能出现其他新的症状，如米尔伊丽莎白菌与海豚链球菌共同感染会引起牛蛙歪头、腹胀、腹水、后肢充血发红、肝脾肾充血、肿大的症状外，还会出现后肢水肿、肝脏硬化的症状。2.6  耐药性分析
分离的20株代表菌株对11种常见抗菌药物（磺胺甲二唑、氯霉素、庆大霉素、复方新诺明、红霉素、青霉素、氟苯尼考、麦迪霉素、新霉素、恩诺沙星、多西环素）耐药性检测结果，见表3。结果发现多数菌株表现出多重耐药性，如9株伊丽莎白菌至少对5种药物具有耐药性，其中维氏气单胞菌WS4对7种药物耐受；不动杆菌菌株BD7对8种药物耐受；伊丽莎白菌MY38和无乳链球菌WR5分别对9种药物耐受。
3  讨论
牛蛙自1959年从古巴引进以来深受我国消费者的喜爱，近年全国牛蛙产品消费量增长迅速，2020年以牛蛙产品为主的餐饮门店达4万多家，推动牛蛙养殖业迅猛发展[22]。2021年牛蛙养殖产量达到60万t ，是我国重要的名特水产品，也是乡村振兴的优质养殖种类[23]。广东省是牛蛙养殖大省，长期以来牛蛙产量占全国的一半左右。随着广东省牛蛙养殖规模的不断扩大，养殖密度过高，病害问题逐渐严重，对养殖产业的危害也越来越大。本研究于2020年11月—2022年10月对广东省养殖牛蛙开展流行病学调查，共检测病蛙351例，发现不同地
其他43株，  23.76%
不动杆菌23株，      12.71%
肺炎克雷伯氏菌7株，            3.87%
弧菌9株，4.97%
爱德华氏菌5株，        2.76%
链球菌23株，    12.71%
气单胞菌30株，      16.57%
伊丽莎白菌41株，        22.65%
300
200
100
病害种类比例病害种类数量
细菌感染80
60
40
20
细菌病毒混合感染不明原因死亡病
病害种类占比（%）病害种类数量（例）
区采集的病蛙疾病流行情况相似，流行疾病以细菌感染为主，病毒主要与细菌混合感染，未发现单一病毒感染与寄生虫感染病例。流行病原菌主要有伊丽莎白菌、气单胞菌、链球菌、不动杆菌等，多种细菌混合感染的病例较多，单一细菌感染病例较少。
常见感染蛙类的病毒主要为蛙虹彩病毒3型[24-25]，该病毒属于蛙虹彩病毒属，因而本次流行病调查主要检测蛙虹彩病毒感染情况，结果发现蛙虹彩病毒主要与细菌混合感染牛蛙，占发病病例的9.97%，未
发现单独病毒感染的病例，表明蛙虹彩病毒在牛蛙养殖中也具有一定的危害，在防治过程中要分清主次，有针对性的用药。目前的研究报道感染蛙类的寄生虫主要有感染蝌蚪的车轮虫（Trichodina）[26-27]、锚头鳋（Lernaea）[28]、舌杯虫（Apiosoma）[26-27]和幼虫时期以裂头蚴存在于蛙体肌肉中的曼氏迭宫绦虫（Spirometra mansoni）[27]等，本次流行病学调查主要以蛙为主，未发现车轮虫、锚头鳋和舌杯虫等蝌蚪寄生虫，在病蛙的检测过程中也没有发现曼氏迭宫绦虫等蠕虫感染。蛙类的真菌性疾病有水霉（Saprolegnia）[26-28]、壶菌（Batrachochytrium dendrobatidis）[27]等，水霉感染会出现絮状菌丝，伤口红肿、发炎[28]，而壶菌感染牛蛙则会出现表皮增生，严重的会出现皮肤溃疡和充血[27]。本次流行病学调查结果显示，病蛙体表未出现白絮状与表皮增生的症状，解剖后对其溃烂组织进行显微镜检测也没有观察到真菌感
表2  患病牛蛙发病症状和病原统计
发病症状分离病原
后肢充血发红，白眼，歪头，腹胀，腹水米尔伊丽莎白菌
白眼，后肢充血发红，腹胀，腹水，肝、脾和肾充血肿大无乳链球菌
腹胀，肝和脾肿大海豚链球菌
后肢充血发红，腹水嗜水气单胞菌
头部表皮溃烂，腹水嗜水气单胞菌，不动杆菌
白眼，后肢充血发红，腹胀，血腹水，肝、脾和肾充血肿大米尔伊丽莎白菌，嗜水气单胞菌
后肢水肿与充血发红，腹胀，腹水，肝、脾和肾充血肿大，肝硬化，花斑肝米尔伊丽莎白菌，海豚链球菌
腹部后肢充血发红，肝、脾和肾肿大，肾发黄或发黑按蚊伊丽莎白菌，克雷伯氏菌
腹胀，肝、脾肿大，花斑肝海豚链球菌，不动杆菌，
表皮溃烂，腹水维氏气单胞菌，不动杆菌
花斑肝，肾肿大肺炎克雷伯氏菌，不动杆菌
白眼，后肢充血发红，腹胀，腹水，肠道发炎米尔伊丽莎白菌，弧菌，维氏气单胞菌歪头，后肢充血发红，腹胀，腹水，肛门充血发红米尔伊丽莎白菌，弧菌，蛙虹彩病毒
后肢充血发红，白眼，肝、脾和肾充血，肝硬化，脾肿大，肠道阻塞，胃部食物淤积无乳链球菌，嗜水
气单胞菌，米尔伊丽莎白菌，蛙虹彩病毒
后肢充血发红，白眼，腹胀，腹水，肝、脾与肾充血肿大，肝硬化米尔伊丽莎白菌，无乳链球菌，蛙虹彩病毒
表3  菌株耐药实验结果
菌珠
磺胺
甲二唑
氯霉素
庆大
霉素
复方
新诺明
红霉素青霉素
氟苯
尼考
麦迪
霉素
硫酸
新霉素
恩诺
沙星
多西
环素
米尔伊丽莎白菌（MY1）R R R R S R S S R S S 米尔伊丽莎白菌（MY7）R R R S S R S S R S S 米尔伊丽莎白菌（MY12）R R R R S R S S R S S 米尔伊丽莎白菌（MY19）R R R I S R S S R S S 米尔伊丽莎白菌（MY22）R R R I S R S I R R S 米尔伊丽莎白菌（MY23）R R R R S R S S R R S 米尔伊丽莎白菌（MY38）R R R R R R R R R S I 按蚊伊丽莎白菌（AY1）R R R R I R S R R S I 按蚊伊丽莎白菌（AY2）R I R R R R I R R I R 海豚链球菌（HT15）R I R R S S S S I I S 肺炎克雷伯氏菌（KLB4）S R I S R R I R R S S 不动杆菌（BD3）S R S S I R I R S I S 不动杆菌（BD7）R R R R R R R I R I I 不动杆菌（BD12）S S S I S I S I I S S 不动杆菌（BD21）S S I I I R S I I S S 弧菌（HT9）R S S S S S S S R S S 嗜水气单胞菌（SH10）R S S R S R S R I S S 嗜水气单胞菌（SH23）I S I S I R S R I S S 维氏气单胞菌（WS4）R S S R R R R R S R S 无乳链球菌（WR5）R R S R R R R R I R R 注：“S”表示高度敏感；“I”表示中度敏感；“R”表示不敏感。
染的情况。
目前已报道较多的牛蛙病原菌有嗜水气单胞菌[29]、伊丽莎白菌[30-32]、不动杆菌[33-34]、爱德华氏菌[35-37]、链球菌[38-39]等。本次流行病学调查除分离到伊丽莎白菌、链球菌、气单胞菌、爱德华氏菌、不动杆菌等常见病原菌外，还分离到多株弧菌和肺炎克雷伯氏菌等菌株，这些菌株是否是牛蛙疾病的主要致病菌还需进一步研究。弧菌和肺炎克雷伯氏菌都是人类常见的病原菌[40-43]，这些菌株的发现对公共卫生存在潜在的风险，在养殖过程中应引起重视。调查还发现细菌混合感染病例较多，混合
感染病蛙症状更加复杂、严重，如伊丽莎白菌与气单胞菌混合感染牛蛙会出现眼球浑浊，后肢充血发红，腹胀等症状的同时，还出现腹水，肝、脾和肾充血、肿大等症状，多种病原菌混合感染会加重牛蛙的疾病，更加困难，引起更大的损失，在病害防控过程中应注意准主要病因，采取措施针对性的进行预防和。
“歪头病”是近年蛙类常见的疾病之一，其典型症状为病蛙歪头、眼球浑浊、红腿、腹水等，一直以来的研究认为“歪头病”的病原为脑膜炎败血伊丽莎白菌（Elizabethkingia meningoseptica）[8,27,44-45]，2018年秦振阳等[32]研究发现米尔伊丽莎白菌可以引起黑斑蛙“歪头病”，2020年胡瑞雪等[31]通过全基因组测序证实米尔伊丽莎白菌是黑斑蛙“歪头病”的主要病原，并且认为可能早期“歪头病”病原报道误把米尔伊丽莎白菌鉴定为脑膜炎败血伊丽莎白菌。本次流行病调查从歪头症状的牛蛙中分离到39株米尔伊丽莎白菌，占分离菌株的21.55%，未分离到脑膜炎败血伊丽莎白菌，与胡瑞雪等[31]的研究结果一致。
本次调查发现，牛蛙疾病常见症状有歪头、眼球浑浊、红腿、腹胀、腹水、肠炎等，生产上养殖户采用症状对疾病进行命名，目前研究发现多种病原都可能引起相同的症状，如刘春等[30]与胡瑞雪等[31]报道米尔伊丽莎白菌感染会引起牛蛙歪头、眼球浑浊等症状，夏理海等[46]报道肺炎克雷伯氏菌也会引起黑斑蛙的歪头、白眼等症状，习志江等[8]也报道醋酸钙不动杆菌（Acinetobacter calcoaceticus）感染会引起病蛙的眼球浑浊；汪建国等[26]报道红腿病的病原嗜水气单胞菌，舒新华等[15]与胡成钰等[47]也报道奇异变形杆菌（Proteus mirabilis）、不动杆菌也有红腿现象，我们流行病调查过程中也发现无乳链球
菌、米尔伊丽莎白菌都会引起红腿症状。这些引起相同症状的病原在养殖过程中的防控措施是不一样的，建议研究过程中以病原统一对牛蛙疾病进行命名。
本次流行病学调查发现分离菌株普遍具有多重耐药性，其中占分离菌株比例最高的伊丽莎白菌菌株至少对5种抗生素具有耐药性，胡瑞雪等[31]研究发现伊丽莎白菌对β-内酰胺类、氟喹诺酮类等抗生素都表现出高度耐药性，秦振阳等[32]研究发现米尔伊丽莎白菌存在多个耐药基因，认为其耐药性的产生可能与养殖人员抗生素使用日常化、单一化，导致病原菌耐药性增强，本次流行病学调查也发现养殖过程中存在盲目使用抗生素和滥用抗生素的情况，这些可能都是导致牛蛙病原菌株耐药性较强的原因。在牛蛙养殖过程中要引导养殖户建立“以防为主，治病为辅”养殖观念，杜绝无指征预防使用抗生素，在牛蛙病害过程中精准用药，防止病原菌株耐药性增强。
4  结论
本研究通过对广东多地养殖牛蛙开展流行病学调查，共采集样本62批，检测病蛙351例，发现发病牛蛙细菌感染病例较多，寄生虫与真菌感染病例较少，病毒主要与细菌混合感染；感染菌株中伊丽莎白菌最多，其次为气单胞菌，细菌疾病主要为多种细菌混合感染。调查还发现，分离菌株普遍具有多重耐药性，多数分离菌株对氟苯尼考、多西环素、恩诺沙星敏感。
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