三叶木通下胚轴愈伤组织诱导及分化
三叶木通下胚轴愈伤组织诱导及分化
作者：苏慧慧　韩兴杰　李同建　徐玲玲　徐小青　胡兰英 廖亮
来源：《江苏农业科学》2015年第07期
        摘要：以三叶木通试管苗下胚轴为材料，研究不同激素配比对三叶木通下胚轴愈伤组织诱导、分化的影响，比较光照及不同抗褐化剂对防止愈伤组织褐化的影响。结果表明，当2，4-D浓度为2.0 mg/L、NAA 0.2 mg/L时，愈伤组织诱导率高达96.5%；黑暗处理比光照更有利于愈伤组织的诱导，0.6 g/L PVP对预防愈伤组织褐化具有较好的效果；TDZ的浓度对愈伤组织的分化有着重要的影响，适合愈伤组织分化的最佳培养基为：MS+TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+PVP 0.6 g/L。
        关键词：三叶木通；愈伤组织；分化
        中图分类号：S567.904.3 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2015）07-0050-03
        三叶木通[Akebia trifoliata （Thunb.） Koidz]是木通科（Lardizabalaceae）木通属（Akebia）的一种果实营养价值较高的半落叶藤本野生果树[1]，别称八月瓜、八月扎、炸瓜。
主要分布于中国甘肃南部、陕西南部，湖南、湖北、山西、河南等地也有少量分布[2]。研究发现，三叶木通种子脂肪酸含量较高，且主要以不饱和脂肪酸为主[3]；果实味美、营养丰富，蛋白质、氨基酸、可溶性糖、有机酸和矿物质含量也很高，被誉为果中之王[4]，具有较高的经济价值和开发价值。三叶木通是中国传统中药，有清心火、利小便、通经下乳作用[5]。近年来，国内学者对三叶木通的研究主要集中在药用成分分析以及扦插栽培等方面[6-7]，组织培养方面研究较少，目前，只有愈伤组织诱导的研究，且诱导率较低，尚无关于三叶木通愈伤组织分化成苗的相关报道。本试验对三叶木通下胚轴愈伤组织诱导及分化进行了研究，研究不同生长调节剂种类、浓度组合对三叶木通下胚轴再生的影响，以期建立三叶木通下胚轴高效离体再生体系，为其遗传转化体系的建立奠定基础。
        1 材料与方法
        1.1 材料
        三叶木通种子由湖南怀化种植基地提供。
        1.2 方法
        1.2.1 无菌外植体的获取 挑选富有光泽、饱满的种子，置于超净工作台内，无菌水浸泡24 h，使其充分膨胀。75%的乙醇浸泡30 s，无菌水冲洗3次，0.1%的浸泡10 min，无菌水冲洗3次，置于无菌滤纸上吸干多余水分，用解剖针划开种皮，将胚取出，分别接种于MS培养基、1/2 MS培养基、MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.1 mg/L和1/2 MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.1 mg/L培养基中诱导种子萌发，24 h光照培养7 d，统计试验结果。
        1.2.2 愈伤组织诱导培养基的筛选 切取长度约为5 mm的三叶木通下胚轴，以MS为基本培养基，选用3因素3水平正交试验设计L9（33）方案，观察2，4-D、NAA、KT 3种植物激素的浓度及配比对愈伤组织诱导的影响（黑暗培养），每瓶接5个材料，每组处理10瓶，40 d后统计愈伤组织诱导结果。
        1.2.3 光照对愈伤组织诱导影响及抗褐化剂的筛选 切取长度约为5 mm的下胚轴，接种于MS+2，4-D 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L中，分别进行黑暗、光照、黑暗20 d再光照 20 d 3种处理方案培养，定期观察并记录生长情况，40 d后统计试验结果。将约5 mm大小的外植体接种于愈伤诱导培养基MS+2，4-D 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L中，分别添加维生素C 10、20、50 mg/L，AC（活性炭）0.5、黑暗组织0.8、1.0 g/L，PVP（聚乙烯吡咯烷酮）0.6、0.8、1.0 g/L的
抗氧化剂和吸附剂，以不添加任何抗褐化剂和吸附剂作为空白对照，黑暗处理，40 d后统计愈伤组织的褐化程度及生长状态。
        1.2.4 愈伤组织分化培养基的筛选 将长势较好的愈伤组织转移于培养基：（1） MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+PVP 0.6 g/L；（2） MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA0.2 mg/L+PVP 0.6 g/L；（3） MS+TDZ 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+PVP 0.6 g/L；（4） MS+TDZ 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+PVP 0.6 g/L，每瓶接5个材料，每个处理重复10瓶。黑暗处理 10 d 后，光照培养，50 d后分别观察并记录愈伤组织分化结果。
        1.2.5 培养条件 培养基pH值为5.8～5.9，琼脂8 g/L，蔗糖30 g/L，培养温度（24±1） ℃，培养室湿度为60%～70%，光照时间为24 h/d（黑暗处理及光照试验除外），光照度为1 200～1 500 lx。
        2 结果与分析
        2.1 不同培养基对无菌外植体获得的影响
        观察发现，3 d后接种在MS和1/2MS培养基中的种胚变绿且子叶张开，下胚轴开始伸长；
另外2组培养基几乎没有变化。7 d后不同培养基中的下胚轴长度存在差异，子叶形态也不同（表1）。接种于MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.1 mg/L和1/2 MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.1 mg/L培养基中的种胚不能形成健壮幼苗，发育畸形。因此，将MS培养基作为获得外植体的最佳培养基。
        2.2 愈伤组织诱导培养基的选择
        观察发现，接种7 d左右下胚轴两端切口处开始膨大，40 d 后愈伤组织形成，愈伤组织诱导结果见表2。当激素配比为2，4-D 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L时，愈伤诱导率最高，为96.5%。为进一步观察各控制变量是否对观测变量产生影响，利用SPSS软件进行多因素多水平的方差分析，结果见表3。
        由表3可知，2，4-D、NAA 2个因素对愈伤组织诱导率的影响都极为显著，KT则不显著。即2，4-D、NAA 2种激素的3种浓度处理间差异均为显著；KT的3种浓度处理间差异不显著。为了筛选2，4-D、NAA的最佳浓度，对2因素进行Duncan检验，结果见表4、表5。
        2.2.1 2，4-D 3个浓度水平的Duncan检验 多重分析比较结果见表4，2，4-D 3个浓度间
差异显著；2.4-D 3.0 mg/L与 4.0 mg/L 差异极显著，就平均值来看2，4-D 2.0 mg/L的诱导平均值最高，因此，确定三叶木通下胚轴愈伤组织诱导适宜的2，4-D浓度为2.0 mg/L。
        2.2.2 NAA 3个浓度水平的Duncan检验 多重分析比较结果见表5，NAA的3个浓度间差异显著；而NAA 0.2 mg/L与 06 mg/L 间差异极显著。 就平均值来看， NAA 0.2 mg/L 平
        均值最高，因此，确定三叶木通下胚轴愈伤组织诱导适宜的NAA浓度为0.2 mg/L。
        试验结果表明，2，4-D、NAA 2种植物激素及其配比对愈伤组织的诱导率有极显著影响，当2，4-D浓度为2.0 mg/L，NAA浓度为0.2 mg/L时愈伤组织诱导率最高。
        2.3 光照时间及不同抗褐化剂对愈伤组织的影响
        试验结果表明，黑暗处理条件下愈伤组织诱导率最高，且生长状态好，呈浅黄；光照条件下的愈伤组织褐化率高达100%，愈伤组织呈深褐；黑暗20 d再光照20 d培养的愈伤组织开始时呈浅黄，当进行光照培养5 d后观察到约40%愈伤组织开始慢慢变成褐，20 d后愈伤组织的褐化率高达60%。表明黑暗条件下培养可很大程度上降低三叶木通的褐化。不同抗褐化剂对愈伤组织的影响见表6。
        常用抗氧化剂维生素C 及吸附剂AC 并没有起到很好的抗褐化作用，而PVP 0.6 g/L对防止褐化有相对较好作用，本结果与刘香在超声对三叶木通叶片愈伤组织生长及代谢影响得出的结论[8]一致。

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