植物组织培养中的常见问题及对策
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20世纪30年代以来，随着现代科学技术的快速发展，植物组织培养技术得到了广泛的发展和应用。目前，利用植物组织培养技术能使离开本体的植物体重新分化芽苗，得到新的小植株，具有快速繁殖能力的植物品种已经多达千种以上。但是，无论初代还是继代的植物培养都存在易受污染物影响、易黄化和褐化导致枯死的现象，植物组织培养中还存在着不确定的变异率。这些问题严重影响外植体的进一步脱离分化和再分化，成为植物组织培养的拦路虎，绝对不可小觑。
通过分析以上植物组织培养中的问题，研究其解决对策并加以执行，对提升植物组织培养成功率具有积极作用，也是当下值得深入探索的重要问题。
1植物组织培养过程中的污染问题及对策
1.1植物组织培养过程中污染问题的危害及其成因
污染问题一直是植物组织培养过程中的重大问题。植物组织培养过程中有适宜快速繁殖的条件，微生物也能在其中快速繁殖，给试验材料产生不同程度的霉变、浑浊、云雾状、粘液状、泡沫状等形状、颜和大小不同的污染痕迹。污染问题带来的直接影响是阻碍植物组织培养材料的良好保存和新产品植株的培育。同时，污染问题背后造成大量间接影响，带来大量的培养材料和前期工作时间的浪费，影响植物组织培养
进度，被迫提高科研成本，阻碍科研和生存项目的发展。植物组织培养过程中的污染原因大致包括：植物本身的种类和大小、预处理方法、灭菌消毒方式、人员操作和环境因素四大类。
1.2植物组织培养过程中污染问题的对策
1.2.1选择外植体的种类和大小不同，污染风险等级也不尽相同。在自然环境中难以避免植物本身携带各种真菌、细菌和相关的病虫害。在适宜生长的野生状态下，细菌和病虫害都会影响植物的正常生长，在植物组织培养过程中，其威力更大。植物组织培养过程中，应选取细菌较少或不带细菌的材料作为外植体。避免选择长期生长在存在大量微生物环境中有块茎、鳞茎等器官的外植体。外植体材料表面积越大，各类菌体含量越高，污染几率直线上升。因此，应选择外植体材料表面积较小的植株，降低菌体污染的可能性。
1.2.2利用预处理的方法防止植物组织培养过程中的污染现象。预处理的重点对象是外植体母株。最简单有效的方法是给外植体母株进行45～50℃的水浴处理。水浴处理对植株和培养材料没有任何副作用，并能降低植株的污染率。同时，可以对植株进行黄化处理，相比直接采用野外原生外植体进行培养，黄化处理过的外植体污染率明显降低。
1.2.3消毒灭菌的方式。可尝试将真空减压灭菌、多次消毒灭菌、混合消毒液、灼烧等方法进行有机排列组合达到最优效果。首先，利用减压真空抽走外植体中的气体，使消毒剂能快速、全面地融入组织内部，
可有效增加灭菌效果，降低污染率。其次，根据不同外植体的耐受程度和特性，用不同浓度的酒精进行时间长短不一的浸泡，再进行消毒，可以有效提高消毒效果。以上2种方法可以解决外植体大部分表面污染问题。但许多植株本身携带的细菌不仅附着在表面，还有许多藏在植株内部。通过表面消杀的方法，不能将其彻底消除。在植物组织培养过程中，呈现初代培养无污染，随着继代培养次数增多，细菌量随之增加，出现大批量的继代污染现象。通过在培养皿中加入青霉素等抗生素作为抑菌剂进行深层处理，确保在植物组织培养前，有效消除各种污染的可能性。
1.2.4植物组织培养过程中的环境因素和人员操作对培养植株的影响巨大。空气中难免存在一些真菌孢子和飘散的细菌，超净工作台台面、组织培养操作间需要做到仔细处理。期间借助紫外线灯对工作台进行消毒处理，将各种可能使用到的工具单独存放，避免酒精灯、工作台等直接暴露，与空气中的真菌孢子和飘散的细菌相互接触，造成一系列不良影响[1]。此外，开展操作前，要求接种人员使用酒精棉擦拭双手，喷洒浓度为75%的酒精，达到消毒目的，之后依次穿戴口罩、帽子、无菌白大
植物组织培养中的常见问题及对策
张清凤，李啟菊，马梅见，肖德琴，赵洁，杨静康
（云南省昭通市农业科学院，云南昭通657000）
摘要：植物组织培养技术已经历了将近一个世纪的发展历程。植物快速繁殖优良种苗、无病毒种苗培养、新品种植株研发、工厂化
大批育苗等其相关理论研究和试验技术已经被广泛应用到生产和生活当中，促进了科技经济进一步发展和人民生活条件的不断改善。
但是在植物组织培养中存在易受污染、褐化、黄化等诸多问题，长期制约着物组织培养技术的进步。基于植物组织培养过程中常见的问
题，进行为害分析、原因探究和对策讨论，为植物组织培养技术进一步发展贡献力量。
关键词：植物组织；污染；褐化；黄化；玻璃化；变异率；问题及对策
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褂。潜在带菌材料的处理过程中，要提前预测可能使用到的工具，对其进行彻底消毒处理，及时处理已经发生污染的材料，避免造成污染问题扩散。
2植物组织培养过程中褐化现象及对策
2.1植物组织培养过程中褐化现象的危害及其成因
褐化现象是指外植体在培养过程中，释放出褐化物质，最初影响培养基的颜，随着褐化物质释放量增多，外植体也会受到影响而褐变、死亡。褐化现象的直接影响因素为外植体内含有的酚类化合物数量、酚氧化酶活性状况，一般情况下，木本植物中本身就含有较多酚类化合物，而且两者处于相互分隔且稳定的状态，切割外植体时，切口附近的细胞受到攻击，酚类化合物与多酚化和酶接触。在多酚化和酶的催化下，酚类化合物迅速氧化成褐，经过一系列的酶变。最终导致外植体组织中的蛋白质大量聚合，进一步加快其他酶系统的失活。
2.2植物组织培养过程中褐化现象的对策
根据引发褐化现象的原因，通过控制变量的方法，可有效减少褐变发生。首先，在选取外植体时，尽量选择茎尖、幼胚等有很强分生能力的部位。在适宜的细胞脱分化和再分化培养基下，茎尖、幼胚处于旺盛的生长状态，可以大大减轻褐变的发生。外植体处理时，可对外植体采用20～40d遮光处理[2]。同时，对子叶、胚、茎尖在低温条件下进行12或24h处理，可尽量减少机械作用对外植体的伤害，避免褐变。最后，在培养基的选择方面，无机盐、蔗糖浓度和激素水平以及适宜的pH值都非常关键。条件允许的情况下，在培养过程中可加入柠檬酸等有机酸、抗氧化剂和吸附剂等，吸附和抑制酚类物质。3植物
组织培养过程中玻璃化现象及对策
3.1植物组织培养过程中玻璃化现象的危害及其成因
植物组织培养过程中的玻璃化现象主要表现为植物组织培养苗呈现半透明，且组织结构畸形。玻璃化现象直接造成植物组织的生理功能发生缺陷，无法保障移植时的成活率，这是目前阻碍植物组织培养工作进一步发展的关键问题。就植物组织培养过程中玻璃化现象的发生原因来看，激素的类别和浓度、培养条件等均属于其诱发因素[3]。具体来讲，主要体现在新陈代谢和培育条件两方面。从新陈代谢方面来看，苯丙氨酸解氨酶作为物质体内的重要催化酶，能够发挥促进植物体内木质素和纤维素合成的作用，该酶的活性受到影响直接导致粗纤维含量下降，细胞壁膨压下降，进而呈现为植物组织结构畸形。同时，糖与琼脂浓度与玻璃化苗呈负相关关系。
在培育条件方面。培养的相对温度和湿度，培养基中的无机成分和氮气的供应形态均会影响玻璃化现象的发生。
3.2植物组织培养过程中玻璃化现象的对策
解决玻璃化现象主要可以根据降低水分的基本原则从六大方面进行。（1）在植物组织培养，尤其是固体培养过程中，调节培养基的pH值，可以为保留琼脂提供良好的条件，进而提升培养皿中琼脂浓度，避
免植物组织在培养过程中吸水能力过强，有效预防玻璃化现象的发生。（2）在培养皿内加入一定量的蔗糖或者渗透剂，促使培养皿的碳氮比提升，避免细胞内部与培养皿之间存在过高的渗透压，从根本上减少细胞摄取过量水分的目的。（3）调节培养皿内部的相对湿度，确保环境适宜植物组织的生长，之后通过调整氧气供应状态，实现预防植物组织玻璃化现象。（4）培养基中外源细胞分裂素供应过多，会导致玻璃化现象的发生。适当降低培养基中细胞分裂素和赤霉素的浓度，降低活跃度，自然降低玻璃化率。（5）外植体需进行热击处理，目的是消除植物组织上已经发生的玻璃化现象。（6）增加自然光照，改善培养容器的通风换气条件，利用紫外线使已经玻璃化的植株恢复正常。
4植物组织培养过程中黄化现象及对策
4.1植物组织培养过程中黄化现象的危害及其成因
黄化现象表现的特征是外植体茎、叶的一部分或全部退化，出现黄化或黄绿化现象。黄化现象的科学解释，是在黑暗中植物不能合成叶绿素，但能形成明显的胡萝卜素，导致叶片发黄，称为黄化现象。双子叶植物、禾谷类植物等多种植物的黄化现象虽然表现不同，但原因都大同小异。最关键的因素是植物培养容器中铁元素不足。除此之外，还有乙烯含量高、激素比例不当、糖类长时间不转移、短时间内pH值波动过大、通气不足、光照不足等多种因素都会造成黄化现象。由于黄化现象，致使培养试验失败，造成科研经费增加的案例比比皆是。
4.2植物组织培养过程中黄化现象的对策
黑暗组织
由于黄化现象产生的原因，简单补充各种元素进行预防的效果并不明显。精确控制各类材料的用量是解决植物组织培养中黄化现象的关键所在。（1）无论是配制培养液还是制作培养基，应仔细检查设备是否精密、准确，认真核对每项液体和材料的质量、体积、状态和各项指标。（2）要注意培养基中的糖类指标是否达标，在正常适宜的范围内，增加培养基内的糖类物质。（3）对于已经进行过精密测量和计算的适宜培养环境，要及时转接培养物。随着时间的延长和氧化作用的发生，各项指标会缓慢发生改变。（4）使用透气的封口膜。实时监测培养容器的通气状况。（5）根据植物组织培养情况，适当微调pH值、激素配比和无机盐的浓度。（6）及时调整培养室内的昼夜温度，适当增加光照时间和强度。（7）在使用青霉素、头孢霉素等抗生素类物质时，要注意观察幼苗是否存在黄化现象，发现外植体有黄化苗头，及时减少抗生素用量或停止使用抗生素。
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5植物组织培养过程中变异率高现象及对策
5.1植物组织培养过程中变异率高现象的危害及其成因
变异本身是植物在自然状态下为适应生存环境而进行的一系列改变，但是变异的结果不一定适应植物组织健康繁殖，很有可能使植物组织走向死亡。植物组织培养最终的目标是得到稳定优质的植物资源。一方面，可以防止在自然状态下植物组织基因的丢失和毁灭。另一方面，可以快速繁殖具有商业价值的花卉植株。如果植物组织培养过程中变异率太高，植株属性极不稳定，不但无法选取保留高质量的品类种子，还会严重影响大批量工业化生产。
5.2植物组织培养过程中变异率高现象的对策
在植物组织外植体选择、培养过程中变异的风险无处不在。首先，在原始材料基地的选择方面，尤其是大田生产中，优先考虑植物品种来源清晰、无检疫性病虫害、种植管理水平高的种植区域采种基地，形成植物组织培养原始材料形成稳定可靠的供应地。在条件允许的情况下，每3年定期更换新地，以防止土地肥力不足和化学肥料的污染而引起变异。通过定期筛选出包含原品种典型特征的优良植株，作为植物组织快速繁殖的原始材料。其次，通过反复试验，确定出植物组织的最佳方案。在具体植株培养的过程中，难免出现问题和瑕疵，需要调整配方的成分比例或浓度，但不要随意更改最佳方案。可进行渐进式逐步微调，特别是激素类和抗生素类药，避免急增、骤减用量。将各种成分控制在安全范围内，操作过程要严格按照相关指标进行。在增殖代数的繁殖过程中，不要一味追求数量的繁殖，受最佳配方和操作过程的影响，繁殖代数越多，其潜在的变异风险越大。最后，尽量避免使用愈伤组织进行植物组织培养。愈伤植物的组织和细胞结构相对稳定性较差，存在的潜在风险较大。为保证繁殖体的质量和品质，
尽量切除愈伤体再进行大批量规模化生产。
6结语
综上所述，分析了植物组织培养过程中的污染问题、褐化现象、玻璃化现象、黄化现象和变异率过高这5种常见问题的危害和原因，并在此基础上提出可供参考的应对措施。以期今后的植物组织培养能在外植体筛选育种、环境因素控制、人工操作过程等诸多方面得到实质性的提升。通过更好的防御和控制措施以彻底解决植物组织培养中的各种问题，使植物组织培养技术能够越来越完善，促进植物本身的优质发展，在实际的生产中取得更大的收获和良好的市场发展前景。
（收稿：2022-02-18）参考文献：
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