酶切现象及影响因素详解
1 先说一下酶切对象
(1) 质粒 要是对质粒进行酶切，那么质粒的纯度挺重要，污染有DNase 和残留质粒提取中的酚以及高盐对DNA酶切都不利，还有RNA要去除干净。以上所提的这些这都会影响酶切效果。
解决方法 DNase污染 ：质粒提取的试剂都要进行灭菌，提取时不要拖拉，电泳缓冲液要长换，以免电泳液造成DNA降解，电泳液的pH不要偏酸，容易降解DNA.在最后溶解DNA时，可以采用TE和水，建议用TE，TE可以鳌合金属离子，使DNase失活。酶切时，TE也会有一定影响，但你可以将溶解DNA时的TE少加点。 酶切时，取的DNA的体积就可以减少，经水稀释，就问题不了。
RNA 的去除：一般将RNase加到TE中，经过37度温育一段时间就可以将RNA很好的去除1－2个小时就行。
酚的污染：首先在用酚仿抽提时，就要小心不要吸到下面的有机溶液，要是为了保险可以再用氯仿单独抽提一下，就可以很好的避免酚的残留。
高盐的去除： 提取质粒时一般盐的浓度很高，若有人在70％乙醇洗盐这步不做，也会影响后面酶切。
（2）PCR产物 PCR产物经电泳检测是单一目的条带可以直接酶切，若是杂带很多，就要将目的片段回收再酶切。一般在设计引物的时候，会在5'端引入酶切位点，但是不要忘了在酶切位点外面加几个保护碱基。加入4个比较保险，如果没有保护碱基，内切酶是无法切断DNA的，即使加入保护碱基，酶切效率也会较低， 需要长时间酶切。
（3） 基因组DNA 将基因组做酶切一般是在southern blot 时常用，这时酶切体系一般较大，因为基
因组中目的基因 的比例是很小的，酶切之后转膜又会有损失，因此多做一点酶切产物，才会获得较好的杂交效果。内切酶也要多加一些，一般都要酶切一夜，才能完全酶切。
2 酶切试剂
（1）酶切缓冲液：一般公司会给你的说明书中，告诉你用哪种缓冲液，如果是单酶切，按照说明书上提示即可。要是双酶切，原则是先两种酶有没有可以共用的缓冲液，最好两种
酶同时酶切比较省事。实在是两种酶没有共用缓冲液，就得先进行低盐缓冲液酶切，补充适量盐溶液，再行高盐的缓冲液进行酶切 。
（2）限制性内切酶：一般是在－20度保存，吸取时，从冰箱取出后放在冰上进行操作，而且动作要快，防止酶失活。有的人， 将酶分装几管，每次拿出一管来用，可以更好的避免酶失活。国产的内切酶，比如常用的EcoRI BamHI还可以，但是其他一些酶质量不如国外的可靠，有时你的酶切若出现smear的现象时，总是不到原因，有可能就是酶中的污染。
3 酶切目的
（1）加入多少目的DNA,这要看你的酶切目的是什么,如果你要是回收目的片段，当然是多一些好，而且在电泳之前要更换电泳液，以免污染。要是只进行酶切鉴定，就可以少加一些目的片段。
（2）如果单一的目的片段酶切连接，在 酶切之后要将酶进行加热失活，或者用酚氯仿进行抽提，纯化。
（3）要获得不完全酶切的产物，一般都是控制酶切的时间，进行梯度延长酶切，可以获得
你所要的最佳酶切时间。
4 酶切温度
一般常用的内切酶都是在37度是最佳的酶切反应温度，也有一些酶是低温活性更好，有的是28度
【酶切问题讨论专栏】
【酶切问题讨论专栏】
如何选择酶切缓冲液，如何提高酶切效率，尤其是PCR产物的酶切、双酶切、特殊酶切，总结了以下几点，希望对大家有帮助，欢迎补充！
1.PCR产物的酶切。
PCR产物的酶切与引物上引入的保护碱基有很大的关系，所以设计引物的时候就应该注意到这一点，如何选择保护碱基，具体参见NEB网站上关于保护碱基的资料:
PCR产物的酶切相关的帖子：
www.dxy/bbs/actions/archie/post/242899_1.html
www.dxy/bbs/post/iew?bid=64&id=818980&tpg=1&ppg=1&sty=1&age=0#818980
www.dxy/bbs/post/iew?bid=64&id=620693&tpg=1&ppg=1&sty=1&age=0#620693
www.dxy/bbs/post/iew?bid=64&id=720799&tpg=1&ppg=1&sty=1&age=0#720799
2.加了保护碱基可能也会遇到切不动的问题，切不动可以从以下方面考虑：
（1）酶切缓冲液。每种酶都有公司提供的最佳缓冲液，它们的差别只是离子浓度与体系的不同，如Na、k、Mg等，还有PH值及缓冲体系（一般Tris-HCl），另外酶加甘油和DTT作为保护剂。在双酶切的时候常会遇到两种酶有各自的缓冲液，要达到高酶切效率，选择是个问题，如果酶切时间和量足够，解决的方法：
（A）使用其中一个酶的缓冲液，但要考虑到另一酶的反应效率，反应效率如何，可以查查酶在不同buffer里的效率参数，具体见，如NEB提供了很好的buffer参数:
b/neb/tech/tech_resource/restriction/buffers/buffer_chart.html。
（B）使用它们的通用的缓冲液，使两种酶在同一缓冲液里达到也足够的酶切效率；没有通用的BUFFER怎么办呢？ 分两次酶切。即先用一种酶切，胶回收后再用另一种酶切。一般先低盐后高盐，这种方法保证了在各自的酶切缓冲液中都得到最大的酶切效率，但缺点是要回收，损失大 ；
（C）克隆到T载体中，值得推荐的方法，克隆到T载体中，不须要考虑受这个条件的限制，酶切位点也可以用T载体上自带的。
（2）酶切温度。酶切温度也很重要，一般的酶切最适温度为37度，有些特殊的酶的反应温度不同，如Sma Ⅰ为30度。双酶切时这种情况下最好分开切，先低温后高温。
（3）酶切时间。酶切时间直接影响到酶切是否完全，一般为1-3h，这个时间已经足够，对于一些活性较好的酶，30min就可以酶切完全，建议在酶切1h后取5ul跑电泳以鉴定酶切效率；PCR产物的酶切时间较长，一般过夜。
（4）酶失活。如果使用酶解冻后放置太久，可能导致酶失活。这种情况较少见，只能换新酶。如果拿了不同公司的酶，buffer也不一样，怎么办？放心，可以用不同公司的酶进行双
酶切，一般不会有问题的。可以先查查NEB的酶在不同缓冲液中的活性百分比，选择它们都有适中活性的buffer，每个公司生产的酶反应缓冲液针对特定内切酶是最合适的！
(5）酶切体系。选用多大的酶切体系取决于你的样品浓度，在双酶切的时候为了得到质量高的电泳图，尤其插入的是小片段DNA，酶切后产物量较少，可以增加酶切重组DNA的量和增加上样量，建议酶切前测定一下DNA浓度或跑电泳看看DNA有多浓，做到心中有数。
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关于保护碱基的资料:
Cleaage Close to the End of DNA Fragment1.doc (104.5k)
wangjun2002274的工作非常出，建议加分，值得学习!
支持
请问前辈：为什么双酶切时要先切低温再切高温？
如果酶切过夜会影响酶切效果吗？
主要是考虑到酶活性的维持。
温度对酶的活性影响很大，温度高，容易造成某些酶的失活；双酶切时，由于有2种的限制酶存在，2种酶可能有不同的最适反应温点，当1种酶在其最适温点反应时，为了不使另1 种酶降解或失活，所以双酶切时要先切低温再切高温。
请问PCR产物酶切过夜，对连接没影响吗？ 什么是bbs
紧急求助！万分感谢构建ector 3个月没结果！
我的载体是PstI单酶切，脱磷。目的片段是PCR产物切胶回收PstI单酶切（切2.5h,引物设计加6个保护碱基),，然后又切胶回收，再连接，阴性对照长一些兰斑（可能脱磷不彻底），但样品只长几个白斑，鉴定全是假的。请问高手问题出在哪？是不是目的片段没切动导致没连
上？载体是pCAMBIA1300, 目的片段9.7kb。
你的目的片段9.7kb,有点大, 胶连有点困难了.可以考虑液连.用Agrose酶把你的胶溶解.并提高目的片段的纯度和浓度.
还有就是你的PCR产物PstI单酶切的问题,因为你跑胶看不出酶切的效果.可用一有PstI酶切位点的环质做对照一起酶切,可以看出部分问题.
你的载体脱磷也确实是个麻烦,每次做阴性对照也很对,但脱磷的程度要看你自己的掌握了,脱磷不彻底和太过了也不好.不过,CIP一定要保证活性.最好用新的.
非常谢谢biotin, 我再试试。
我个人认为，一般不到万不得已，没必要先回收再酶切，损失太大，绝大多数双酶切可在1×通用buffer中先切1小时，再在2×通用buffer中切1小时，可解决绝大多数酶切问题。
不过先回收，也能保证酶切的效率，如果PCR的产物量满意的话，回收的损失可以忽略不计。毕竟酶切的效率对于克隆化相对更重要一些。
过去，早期的内切酶有星活性，过度酶切能给产物切的七零八落，现在好像已经没有这个问题了，早些年曾经遇到过把产物切碎了的情况。
是不是引物上加酶切位点的才需要保护碱基？
我的酶切位点都在PCR产物内部包含，还需要在引物上加保护碱基么？
不需要的，连接到T载体上直接就可以酶切鉴定！
我的PCR产物的酶切位点XbaI的保护性碱基是CG,HbaI也是CG，会影响我的酶切吗，我十分担心，高手能指点一下吗
我的质粒是pcdna3.1+cfp-c1 , 6000多bp！有一个not1的酶切位点，我酶切了很多次都没有成功？酶切都是2条带。我用50ul体系，加了15ul的质粒（100ng/ul），2ul的酶，发应了10个小时还没有切动。请高手指点，谢谢了！
wangjun2002274 wrote:
不需要的，连接到T载体上直接就可以酶切鉴定！
:)谢谢，小女子初涉江湖很多问题不懂，
在这里可以学得到很多好东东，
谢谢！
我现在双酶切一个T载体连接产物,用的是和EcoRI,先用BamHI30度切5小时,之后沉淀线性DNA,方法是:加入1/10体积的乙酸钠和风细雨2.5体积的无水乙醇,18000转15分钟离心,再加入70%乙醇15000转离心10分钟,最后等乙醇挥发干净了再加入EcoRI的酶切体系37度切5小时.可是结果总是不对.本应该是2000和3000两条带,可是总是出现不正确的带,或者根本就乱七八糟,怎么回事啊?请大家 帮帮忙!
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