高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株荧光定量PCR检测方法的建立
高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株荧光定量PCR 检测方法的建立
王秋泉邓中平★
[摘要]
目的
应用荧光定量PCR 技术实现高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株的快速鉴
定。
方法利用所报道的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株Nsp2基因片段设计引物和探针，并
对该方法进行特异度、灵敏度、重复性等方面的考察。
结果
用该方法检测高致病性猪繁殖与呼吸综合
征病毒的近源种未发生非特异性扩增，最低检出浓度为1.0×103copy/mL 。
结论
用该荧光定量PCR 检测
方法检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株不仅特异度好、灵敏度高，且快速简便。
[关键词]高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株；荧光定量；PCR
Development of real-time quantitative RT-PCR assay for detection of highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus
WANG Qiuquan ，DENG Zhongping
(DaAn Gene Diagnostic Center of Sun Yat-sen University,Guangdong,Guangzhou 510665,China)
[ABSTRACT]Objective Using real-time PCR technique to identify highly pathogenic PRRSV
rapidly.
Methods Primers for specific PCR amplification were designed based on the published sequence of the Nsp2region of viral genome of highly pathogenic PRRSV .Its specificity ，sensitivity and stability w
as examined.
Results
Using this method to detect highly pathogenic PRRSV and other virus of reproductive
syndrome,only highly pathogenic PRRSV can be detected,and as little as 103copy/mL of highly pathogenic PRRSV RNA can be amplified.Conclusion PCR amplification targeting at the Nsp2region of viral genome
of highly pathogenic PRRSV is a rapid,specific,sensitive and relatively simple method for the identification of
highly pathogenic PRRSV .
[KEY WORDS]
Highly pathogenic PRRSV ；Real-time ；PCR
基金项目：国家科技重大专项（2008ZX10101）
猪流感的具体症状
作者单位：中山大学达安基因诊断中心，广东，广州510665
★
通讯作者：邓中平，E-mail:dzp2007kc@163
猪繁殖与呼吸系统综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS ）又称猪蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV ）引起的一种高度接触性传染病，以引起母猪繁殖障碍、仔猪和育肥猪呼吸道症状为主要特征［1，2］。该病在全世界范围内大规模的流行，给养猪业造成了极大的经济损失［3］。2006年夏季，我国中南部爆发了高致病性猪蓝耳病，之后蔓延到全国各个省市［4］。其病原已确定是Nsp2基
因发生连续缺失的高致病性PRRSV变异株［5，6］。高致病性猪蓝耳病能使不同年龄和不同品种的猪都感染发病，且发病率高、病死率高、治愈率低。2007年，全国共有26个省份发生了高致病性猪蓝耳病，发病猪数量达30多万头。直至今日，疫病形势依然严峻，严重地影响了我国畜牧业生产［4，6］。因此，为了监测和控制高致病性猪蓝耳病的感染，研究高致病性PRRSV变异株的快速检测方法具有重要意义。
·论著·
1材料与方法1.1
仪器和试剂
主要仪器为ABI 7500荧光定量PCR 仪；质粒抽提试剂盒、pMD 18-T 载体购自大连宝生物工程有限公司；RT 酶、RNasin 购自Promage 生物工程有限公司；DH5α、定量PCR buffer、Taq 酶、dNTP 均由中山大学达安基因股份有限公司提供。1.2
引物与探针
以发生基因缺失的Nsp2片段作为扩增靶区，设计了引物和TaqMan 探针。引物和探针均由中山大学达安
基因股份有限公司提供。1.3
病毒RNA 的提取
病毒RNA 用Trizol 试剂进行提取。具体操作：用Trizol 试剂对适量的组织样品进行裂解，然后用氯仿、异丙醇和75%乙醇对裂解产物进行抽提纯化。1.4
标准阳性模板的制备
用特异性引物对提取的病毒RNA 进行PCR 扩增，所得到的cDNA 经纯化后，克隆到pMD 18-T 载体中并转化入DH5α大肠杆菌。提取含有目的基因的质粒作为标准阳性模板，并通过测定OD 值确定质粒的浓度，-20℃保存备用。1.5
荧光定量PCR 反应条件的优化
对荧光定量PCR的循环参数、引物和探针浓度、RT 酶和Tap酶、RNasin的用量，以及镁离子和dNTP的浓度等进行筛选优化，确定最佳的荧光定量PCR反应条件。1.6
特异性实验
提取猪瘟病毒、猪细小病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、PRRSV非缺失株（经典PRRSV株)及猪链球菌的核酸，用上述荧光定量PCR进行检测，检验其特异性。1.7
灵敏度实验
将已计算出拷贝数的含目的基因的质粒做10倍
梯度稀释，稀释至用荧光定量PCR 仪不能检出，以此计算出荧光定量PCR 所能检出的最低模板拷贝数。1.8
标准曲线的建立
以10倍梯度稀释的1.0×103~1.0×107copy/mL 共5个梯度的质粒为模板，在ABI 7500荧光定量PCR 仪上检测，得到动力学曲线，并计算出相应的标准曲线。1.9
重复性实验
用上述荧光定量PCR 对同一份阳性样本进行重复检测6次，并对检测结果进行统计学分析。1.10
临床样本检测
6份临床鉴定为高致病性PRRSV 变异株感染的猪的肺脏组织来源于华南农业大学兽医学院，用Trizol 试剂提取组织RNA，并用上述荧光定量PCR 进行检测。同时对阳性样本进行克隆测序，验证其是否为高致病性PRRSV 变异株感染。2结果2.1
荧光定量PCR 的反应条件
经筛选，用于PCR扩增反应液中的最佳引物浓度为0.4μmol/L、探针浓度为0.2μmol/L；最佳镁离子浓度为2.1mmol/L、Tap酶最佳用量为5U、RT酶最佳用量为100U、RNasin 最佳用量为20U、dNTPs 最佳浓度为0.20mmol/L。用于PCR扩增的最佳反应温度和时间为：40℃逆转录25min；然后94℃预变性3min；最后93℃15s，55℃45s，40个循环；每个循环后检测荧光。2.2
特异性实验
猪瘟病毒、猪细小病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、PRRSV 非缺失株（经典PRRSV 株)及猪链球菌的核酸，经此荧光定量PCR 检测均为阴性，说明该方法有很好的特异性。结果如图1所示。2.3
灵敏度检测
图1高致病性PRRSV 变异株特异性实验的荧光定量PCR 结果图
Fig 1
Specific identification of
highly pathogenic
PRRSV by real-time PCR
将已计算出拷贝数的含目的基因的质粒10倍梯度稀释，在荧光定量PCR 仪上得出所能最低浓度为
1.0×103copy /mL，说明该方法具有非常好的灵敏度。结果如图2
所示。
图2高致病性PRRSV 变异株灵敏度实验的荧光定量PCR 结果图曲线1、2、3、4、5、6和7对应的质粒模板浓度分别为1.0×108、1.0×107、1.0×
Fig 2
Sensitivity result of highly pathogenic PRRSV by real-time PCR
106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102copy /mL
The plasmid concent rations of curve 1,2,3,4,5,6and 7were 1.0×108，1.0×
107,1.0×106,1.0×105,1.0×104,1.0×102and 1.0×102
copy/mL
图3荧光定量PCR 扩增高致病性PRRSV 变异株质粒浓度的标准曲线图
Fig 3
Standard curve of highly pathogenic PRRSV by real-time PCR
2.4标准曲线的建立
对1.0×103~1.0×107copy/mL 共5个梯度的质粒，
进行RT-PCR 扩增，反应结束后系统自动生成扩增反应的动力学曲线。通过基线设定，系统自动生成标准
曲线。标准曲线表明，起始模板浓度与Ct 值之间呈良好的线性关系，标准曲线斜率为-2.86，在Y 轴截距为38.40，直线回归方程的相关系数（R 2）＝0.997。结果如图3所示。
2.6临床样品检测
6份临床鉴定为高致病性PRRSV 变异株感染的
样品经荧光定量PCR 检测，扩增曲线的Ct
值分别是
14.45，
14.74，13.95，19.07，30.00，26.39，结合扩增曲线有明显指数增长期，均能够判定为阳性。结果如图5所示。
图4高致病性PRRSV 变异株精密度实验的荧光定量PCR 结果图Fig 4
Precision result of highly pathogenic PRRSV by real-time PCR
2.5重复性实验
用荧光定量PCR 对同一份阳性样品进行重复检
测6次，结果显示不同的扩增曲线均在同一Ct 值范
围，变异系数CV=5.6%，说明该方法的重复性好。结果如图4所示。
图5阳性标本的荧光定量PCR结果图
Fig5Detection result of positive samples by real-time PCR
同时对阳性样品的PCR产物进行克隆测序，基因
序列与高致病性PRRSV变异株JXA1株基因序列的同
源性为99%，证实PCR扩增的产物为高致病性PRRSV
变异株的基因(数据未列出)。表明该荧光定量PCR方
法用于临床检测时其结果真实可靠。
3讨论
PRRSV传统的检测方法主要是病毒的分离培养
鉴定和免疫学检测，但是PRRSV培养的条件苛刻，一
般实验室难以实现，而免疫学检测方法都有敏感度低
或特异性较差的问题[7]。此外，上述的这些检测方法
还存在着无法区分经典PRRSV和现时国内流行的高
致病性PRRSV变异株的局限性。
针对国内流行的高致病性PRRSV变异株基因组
的特点，国内学者建立了高致病性PRRSV RT-PCR检
测技术[5，6]。但是由于传统的PCR检测技术需要对PCR
产物进行电泳或杂交分析等后处理，极易造成PCR产
物污染，导致假阳性，不宜用于临床诊断。近几年发展
起来的实时荧光定量PCR将PCR与荧光检测方法相结
合，具有敏感度和特异性高、重复性和稳定性好、耗时
短、无污染的特点，已成为核酸定量检测的首选方法而
得到广泛应用[8，9]。本实验采用TaqMan探针实时荧光
定量PCR技术，研究高致病性PRRSV变异株的荧光定
量PCR检测方法，以实现快速检测临床样本中的高致
病性PRRSV变异株。荧光定量PCR是PCR定性技术
基础上发展起来的核酸定量技术。它不仅实现了对核
酸模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更
强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时
性和准确性等特点[10]。将其应用于实践，可满足当前
对高致病性PRRSV变异株检测的要求。
本研究建立的荧光定量PCR方法已成功用于对
高致病性PRRSV变异株的检测，对6份高致病性
PRRSV变异株感染样本检测全为阳性，
与临床鉴定的阳性符合率为
100%。该方法具有快速、灵敏、准确、低污染等优点，有广泛的实际用途，在PRRSV的早期检测、预防控制、进出口检疫及基础研究中将会起到重要作用。
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