比索洛尔提高心力衰竭大鼠心肌SERCA2a活性
比索洛尔提高心力衰竭大鼠心肌SERCA2a活性
吴锦波;叶小汉;冼绍祥;董明国
【摘 要】Objective To investigate the effects of bisoprolol on myocardial SERCA2a activity in rats with heart fail-ure.Methods Male SD rats were randomly divided into normal control group (control group), sham operation group ( sham group ) , model group , bisoprolol group ( Bis group ) , captopril group ( Cap group ) and bisoprolol plus captopril group[(Bis+Cap)group], heart failure rat model was induced by intraperitoneal injections of doxorubicin .Distilled water, bisoprolol, captopril or bisoprolol plus captopril were administrated by gastrogavage for 35 days, respectively. Indices of cardiac function and plasma levels of B-type natriuretic peptide ( BNP) were measured , myocardial expres-sion of miR-25-3p was detected by Stem-loop RT-qPCR, myocardial levels of SERCA2a and phospholamban (PLB) were detected by Western blot , myocardial SERCA2a activity was determined by the inorganic phosphorus method . Results Cardiac function in model group decreased significantly while plasma levels of BNP were significantly higher than those of co
ntrol group ( P<0.01 ) .Myocardial expression of miR-25-3p in model group was significantly higher while myocardial levels of SERCA 2a and PLB,SERCA2a activity were significantly lower than those of con-trol group(P<0.01).Cardiac function in Bis group , Cap group and Bis +Cap group improved significantly while plasma levels of BNP were significantly lower than those of model group ( P<0.01 ) .Myocardial expression of miR-25-3p in Bis group, Cap group and Bis +Cap group were significantly lower while myocardial levels of SERCA2a and PLB were significantly higher than those in model group (P<0.01).The SERCA2a/PLB ratio and SERCA2a activity in Bis group and Bis +Cap group were significantly higher than those of model group ( P<0.05 ) .Conclu-sions Bisoprolol therapy improves cardiac function in rats with heart failure , which may be related to inhibition of myocardial miR-25-3p, increasing myocardial SERCA2a and PLB levels, enhancing SERCA2a activity.%目的 观察比索洛尔对心力衰竭大鼠心肌肌浆网钙ATP酶2a(SERCA2a)活性的影响.方法 腹腔注射阿霉素建立大鼠心力衰竭模型.实验分为对照组、假手术组、模型组、比索洛尔组、卡托普利组和比索洛尔+卡托普利组.检测心功能指标;ELISA法检测血浆脑钠肽水平;茎环状引物实时定量PCR检测心肌miR-25-3p表达水平;Western blot
检测心肌SERCA2a和受磷蛋白(PLB)表达水平;定磷法测定心肌SERCA2a活性.结果 与对照组比较,模型组大鼠心功能明显减退(P<0.01),血浆脑钠肽水平和心肌miR-25-3p表达水平明显升高(P<0.01),SERCA2a和PLB表达水平、SERCA2a/PLB比值和SERCA2a活性明显降低(P<0.01);与模型组比较,比索洛尔组、卡托普利组和比索洛尔+卡托普利组大鼠心功能明显改善(P<0.01),血浆脑钠肽水平和心肌miR-25-3p表达水平明显降低(P<0.01),SERCA2a和PLB表达水平明显升高(P<0.01);比索洛尔组和比索洛尔+卡托普利组SERCA2a/PLB比值和SERCA2a活性明显高于模型组(P<0.05).结论 比索洛尔可以下调心肌miR-25-3p表达水平,提高SERCA2a和PLB表达水平,增强SERCA2a活性.
【期刊名称】《基础医学与临床》
【年(卷),期】2017(037)003
【总页数】5页(P386-390)
【关键词】比索洛尔;心力衰竭,充血性;肌浆网钙ATP酶;受磷蛋白
【作 者】吴锦波;叶小汉;冼绍祥;董明国
【作者单位】广州中医药大学博士后流动站,广东广州510405;东莞市中医院心内科,广东东莞523000;东莞市中医院心内科,广东东莞523000;广州中医药大学第一附属医院心内科,广东广州510405;东莞市中医院心内科,广东东莞523000
【正文语种】中 文
【中图分类】R541.6
慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是多种心血管疾病的终末期表现，心肌细胞兴奋-收缩耦联障碍是CHF的基础。肌浆网钙ATP酶2a (sarcoplasmic reticulum calcium ATP-ase 2a，SERCA2a)对兴奋-收缩耦联具有重要调控作用，是CHF的重要靶点[1]。SERCA2a的合成受miR- 25抑制[2]，其活性主要受受磷蛋白(phospholamban，PLB)调控。β受体阻滞剂与血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensin-converting-enzyme inhibitor，ACEI)联合应用，是CHF的基石[3]。研究发现：美托洛尔可以使衰竭心脏SERCA2a的蛋白水平和活性正常化[4]，这是美托洛尔CHF的分子机制之一。心功能不全比索洛尔研究Ⅱ(CIBIS-Ⅱ)临床试验显示，比索洛尔能降低CHF患者的病死率和再住院率[5]，但其分子机制的研究较少。本实验观察比索洛尔对CHF大鼠SERCA2a活性及其对SERCA2a、PLB和miR- 25- 3p表达的
影响，进一步探讨比索洛尔CHF的分子机制。
1.1 材料
SPF级SD雄性大鼠80只，平均体质量(230±20)g(广州中医药大学动物实验中心，动物合格证号：440059000)。比索洛尔(Merck Serono公司)；卡托普利(中美上海施贵宝制药有限公司)；阿霉素(Medchemexpress LLC公司)；(福建古田药业有限公司)；(天津金耀药业有限公司)。Rat BNP EIA试剂盒(RayBiotech.Inc.)；Ca2+-ATP酶试剂盒(南京建成生物科技有限公司)；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)试剂盒(碧云天生物技术有限公司)；β-actin抗体、SERCA2a抗体(Santa Cruz公司)；PLB抗体(Abgent公司)；增强型化学发光(enhanced chemiluminescence, ECL)显液(Millipore公司)；RT-qPCR试剂(DBI公司)。
1.2 方法
1.2.1 动物造模及分组：参照文献[6]制作CHF模型。实验药物采用指南[3]推荐剂量，并经过人与大鼠体表面积换算。80只大鼠随机取10只作为对照组，10只作为假手术组，假手术组腹腔注射10 mL/kg的0.9%氯化钠溶液。剩余60只大鼠用于造模，将成功造模的40只大鼠随机
分为4组：模型组、比索洛尔组、卡托普利组和比索洛尔+卡托普利组，每组10只，分别以蒸馏水(10 mL/kg)、比索洛尔(0.9 mg/kg·d)、卡托普利(10.5 mg/kg·d)和相同剂量的比索洛尔+卡托普利连续灌胃35 d；对照组和假手术组同时以蒸馏水灌胃。
1.2.2 心功能指标检测：干预前后腹腔注射(50 mg/kg)和(5 mg/kg)混合麻醉大鼠，超声测定左室舒张末期和收缩末期内径等指标，计算左室短缩分数(FS)、心博出量(CO)和左室射血分数(LVEF)。
1.2.3 ELISA法检测血浆脑型钠尿肽(BNP)水平：处死大鼠时腹主动脉取血，肝素抗凝，静置1 h，3 000 r/min离心10 min，上清液-20 ℃保存，按试剂盒说明书进行操作。
1.2.4 茎环状引物实时定量PCR检测心肌miR- 25- 3p表达：取心室肌组织100 mg匀浆后，Trizol法抽提总RNA。反转录反应获得cDNA，茎环状引物实时定量PCR测定miR- 25- 3p的表达量。PCR反应条件：94 ℃预变性2 min，94 ℃变性20 s，58 ℃退火20 s，72 ℃ 延伸20 s，PCR 扩增40循环。以U6作为内参，以2-△△Ct公式计算miR- 25- 3p的相对表达水平。引物设计及PCR反应均由广州维伯鑫生物科技有限公司完成。PCR引物见表1。1.2.5 Western blot检测心肌细胞SERCA2 a和PLB的蛋白表达水平：取100 mg心肌组织，冰上裂解1 h，提
取细胞内蛋白，BCA法蛋白定量。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜后牛血清蛋白封闭，经一抗结合后洗膜，二抗结合，洗膜后 ECL 显，软件分析。以SERCA2a 和PLB与β-actin的平均吸光值的比值表示目的蛋白的相对表达量，计算SERCA2a/PLB比值。
1.2.6 定磷法测定SERCA2a活性：参照文献[7]测定心肌SERCA2a活性。
1.3 统计学分析
实验数据采用均数±标准差表示，采用SPSS 13.0 统计软件包进行统计学分析，多组间比较采用单因素方差(one-way ANOVA)分析，SLD-t法进行组间两两比较。
2.1 一般情况及心功能指标
广州2a大学CHF大鼠出现不同程度的食欲减退和张口呼吸等症状。干预后，模型组FS、CO和LVEF明显低于对照组(P<0.01)，比索洛尔组、卡托普利组和比索洛尔+卡托普利组明显高于模型组(P<0.01)(表2)。
2.2 血浆BNP水平
模型组血浆BNP水平明显高于对照组(P<0.01)，比索洛尔组、卡托普利组和比索洛尔+卡托普利组明显低于模型组(P<0.01)(表2)。
2.3 心肌miR- 25- 3p表达水平
模型组miR- 25- 3p 表达水平明显高于对照组(P<0.01)，卡托普利组、比索洛尔组和比索洛尔+卡托普利组明显低于模型组(P<0.01)(图1)。
2.4 心肌细胞SERCA2a和PLB的蛋白表达水平
模型组SERCA2 a和PLB表达水平明显低于对照组(P<0.01)，降幅分别为83.5%和62.4%，SERCA2a降幅大于PLB(P<0.05)。比索洛尔组、卡托普利组和比索洛尔+卡托普利组SERCA2a和PLB表达水平明显高于模型组(P<0.01)，升幅分别为315.3%和122.4%、201.8%和87.2%、311.3%和118.6%，SERCA2a升幅均大于PLB(P<0.01)。比索洛尔组和比索洛尔+卡托普利组SERCA2a/PLB比值明显高于模型组[(6.16±0.34)和(6.05±0.35)比(3.82±0.57)](P<0.05)(图2)。
2.5 心肌SERCA2a活性
模型组SERCA2a活性明显低于对照组(P<0.01)，比索洛尔组和比索洛尔+卡托普利组明显高于模型组(P<0.05)，卡托普利组与模型组比较无明显差异(图3)。

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