武大上交大瞿旭东组Angew甾醇降解途径中双功能还原酶的破译助力重要甾体...
武大上交大瞿旭东组Angew甾醇降解途径中双功能还原酶的破译助力重要甾体药物前体高产
遇见-摘要
4-雄烯二酮（4-AD）和黄体酮（PG）是众多甾体类药物的重要前体，然而目前其工业生产过程受困于生产效率低和环境污染严重等问题。该研究中，作者在植物甾醇的降解途径中发现一个新颖的具有双功能作用的还原酶mnOpccR，该酶既可以以四电子的方式还原3-oxo-4-pregnene-20-carboxyl-CoA (3-OPC-CoA)形成20-hydroxymethyl pregn-4-ene-3-one (4-HBC)，也可以以二电子的方式还原3-oxo-4-pregnene-20-carboxyl aldehyde (3-OPA)形成4-HBC。通过失活或者过表达新金分枝杆菌（Mycobacterium neoaurumntd）中mnOpccR，可分别高效专一地实现4-AD和4-HBC的高产。再通过两步简单合成反应，4-HBC可高效转化形成100 g级的PG。
 
遇见-内容甾体类药物是目前化药工业上仅次于抗生素类药物的第二大类药物，约有400多种药物已应用于临床，每年约1,000,000吨（销售额达1000亿美元）的市场需求。由于此类药物结构的复杂性，其生产主要依靠PG和4-AD的半合成；目前工业上，PG和4-AD的生产主要是通过薯蓣皂苷的化学降解和植物甾醇的生物降解。虽然这些方法已应用多年，但PG生产过程中存在的步骤冗长、产率低和环境污染严重，以及4-AD降解合成过程中副产物4-HBC难以除去等问题仍待解决。目前，化学方面，研究者可直接应用普通试剂仅两步合成就可从4-HBC半合成PG，大大降低了合成成本且简化了合成步骤。然而，4-HBC仅仅是4-AD生产过程中的副产物，其产量较低，如何获得高产的4-HBC，又如何解决4-HBC对4-AD的影响，成为目前需要解决的关键。
Figure 1. 新金分枝杆菌中甾醇的降解途径近年来，研究者发现17-hydroxysteroid/ 22-OH-BNC-CoA 脱氢酶（Hsd4A）与4-HBC的形成相关。将hsd4A 与编码3-ketosteroid Δ1-脱氢酶的基因kstDs同时失活，可使4-HBC的产量提高47-49%。在此基础上，上海交大瞿旭东教授组以可将植物甾醇降解产生68% 4-AD，15% ADD，17% 4-HBC的新金分枝杆菌CCTCC AB2019054为载体，在这个庞大的多酶体系中作者发现一个新颖的双功能还原酶mnOpccR同时参与4-HBC的两个独立合成途径路径中（Figure 1）。
Figure 2. 新金分枝杆菌野生株和各突变菌株的降解产物。I，野生株；II，kstD基因失活菌株；III，kstD和hsd4A共失活菌株；IV，kstD，chsE1-E2，chsH1-H2失活菌株；V，kstD和mnOpccR共失活菌株。
为了提高4-HBC的产量，作者首先将该代谢途径中唯一的kstD失活，结果显示其确实只产4-AD及4-HBC（figure 2, II）。但是当失活hsd4A，目的是阻断7流向8 路径以引导代谢流向retro-aldol消除路径，进而转化为4-HBC。然而，实验结果是对4-HBC的形成并无影响，作者推测这可能是存在另一条或多条与hsd4A功能互补的代谢途径（figure 2, III）。通过失活hsd4A并没有达到积累4-HBC的结果，这促使作者将焦点转移到4-HBC本身的合成途径。于是，作者又猜测10被还原后可能形成4-HBC，尽管目前CoA还原酶只接受alkyl-acyl-CoA作为底物，作者大胆尝试用敲除kstD基因的菌株mJTU1细胞裂解液体外催化10，成功得到12%4-HBC，88% 4-AD，较mJTU1发酵液（17%：83%）中略低，说明部分4-HBC确实是通过10的还原而得（figure 3）。考虑到4-HBC代谢途径处于10还原步骤之前，于是作者又同时失活3-OPC-CoA脱氢酶（ChsE1-E2）和3-OPDC-CoA羟化酶（ChsH1-H2）以阻断4-AD的形成引导代谢流向4-HBC路径。出乎意料的，结果显示虽然4-HBC的产量提高了12%，但是更主要的则是产生了两个新的甾体类化合物11和12，作者推测这可能是高浓度的10激活
了产生11和12的沉默基因（figure 2, IV）。
Figure 3. mJTU1细胞裂解液的生化反应
由乙酰辅酶A还原成乙醇一般需要连续的两电子还原，但也有直接通过4电子还原形成的案例。作者认为4-HBC的形成可能是通过四电子直接还原，通过与其他分支杆菌中所报道的四电子还原酶基因比对，作者在新金分支杆菌基因组中发现了同源性为43% 的基因mnOpccR，异源表达该酶及体外催化显示该酶确实可将10转化为4-HBC。考虑到这类型酶也可催化醛的还原，作者又以9为底物进行催化反应，结果显示mnOpccR确实也可将9转化为4-HBC，且效率较10更高。当失活mnOpccR，4-AD的产量提高了16%，且仅仅使用乙酸乙酯萃取发酵液，就能获得约95%纯度的4-AD（figure 2, V）。另外，当将含有强启动子pG13的mnOpccR质粒，整合到同时敲除kstD和hsd4A的菌株mJTU2中，发现甾醇几乎全部转化为4-HBC（产率约93%，figure 5, III）。

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