沉默lncRNA PCA3减少前列腺癌细胞雄激素受体表达抑制前列腺癌细胞增殖和转移
[摘要] 目的 研究沉默lncRNA PCA3对前列腺癌细胞的影响。 方法 选择前列腺癌细胞LNCaP和C4-2细胞，使用siRNA干扰PCA3在细胞内的表达，实时定量PCR法检测干扰效果，检测siRNA干扰PCA3后对前列腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响，Western blot法在前列腺癌C4-2细胞内分别检测雄激素受体及其变体7的表达情况。 结果 PCA3特异性的siRNA可明显抑制前列腺癌细胞内PCA3 mRNA的表达，抑制前列腺癌细胞增殖、迁移和侵袭潜能。沉默PCA3后的C4-2细胞内雄激素受体及其变体7表达明显减少。 结论 沉默lncRNA PCA3可减少前列腺癌细胞内AR及AR-V7的表达，从而抑制前列腺癌细胞增殖和迁移等恶性转变。
[关键词] 长链非编码RNA;PCA3;siRNA;前列腺癌;雄激素受体
[中图分类号] R737.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2019）34-0021-05
Effect of silencing lncRNA PCA3 on reduction of prostate androgen receptor expression and inhibition of prostate cancer cell proliferation and metastasis
YI Xiaomin1， 2 ZHANG Jun1 LIANG Yu1 SHEN Qunshan1 LI Haibo1
1.Department of Urology， the 901 Hospital of PLA， Hefei 230031， China; 2.Department of Urology， the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University， Nanjing 210029， China
[Abstract] Objective To study the effect of silencing lncRNA PCA3 on prostate cancer cells. Methods The prostate cancer cells LNCaP and C4-2 cells were selected， and siRNA was used to interfere with the expression of PCA3 in cells. The interference effect was detected by real-time quantitative PCR， and the effects of siRNA on PCA3 proliferation， migration and invasion of prostate cancer cells were detected. Western blot method was used to investigate the expression of androgen receptor and its variant 7 in prostate cancer C4-2 cells. Results The expression of PCA3 mRNA in prostate cancer cells and the proliferation， migration and invasion potential of prostate cancer cells were significantly inhibited by CA3-specific siRNA. The expression of androgen receptor and its variant 7 in C4-2 cells after silencing PCA3 was significantly reduced. Conclusion Silencing lncRNA PCA3 can reduce the expression of AR and AR-V7 in prostate cancer cells， thereby inhibiting the malignant transformation of prostate cancer cells， such as proliferati
on and migration.
[Key words] Long-chain non-coding RNA; PCA3; siRNA; Prostate cancer; Androgen receptor
前列腺癌在歐美国家已经成为发病率最高的男性恶性肿瘤，严重危害男性健康。我国前列腺癌的发病率也在不断攀升，患病体也有年轻化的趋势。早期局限性的前列腺癌可通过手术和放射等综合达到治愈，但在发病早期多数患者并不会出现明显不适。只有在肿瘤迁延进展、侵犯临近组织甚至发生骨转移后，方有可能被患者察觉。通过手术或药物去势的雄激素剥夺是晚期前列腺癌的主要方法，但多数患者在经历大约16个月之后都将转变为去势抵抗性前列腺癌（Castration resistant prostate cancer，CRPC），此时继续行雄激素剥夺的内分泌不再有效[1]。
早期前列腺癌细胞依赖雄激素-雄激素受体信号轴不断增殖是前列腺癌内分泌方案的基础。正常前列腺上皮细胞和前列腺癌上皮细胞在雄激素激活雄激素受体后可产生前列腺特异性抗原（prostate-specific antigen，PSA）并维持存活。前列腺癌的雄激素受体（Androgen receptor，AR）还可出现异常剪接，形成不同的雄激素受体变体（AR Variants，AR-V），
而变体同源/异源二聚体化后能够不依赖雄激素实现自激活维持增殖信号[2]。明显升高的雄激素受体变体7（AR-V7）水平直接关系到前列腺癌的效果，也是前列腺癌细胞产生去势抵抗的一个重要因素[3，4]。
非编码RNA在表观遗传学的调控机制中发挥重要作用，非编码RNA（noncoding RNA，ncRNA）是一种不能够翻译为蛋白的功能性RNA序列，常见的具有调控作用的非编码RNA包括小干扰RNA、miRNA、piRNA以及长链非编码RNA。PCA3（Prostate Cancer Associated 3）是一个仅在前列腺组织内特异性表达的长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA），其基因座位于9号染体q21～22。前列腺癌内PCA3的表达水平可达到正常前列腺组织的66倍[5]。不仅如此，PCA3高表达还可增加前列腺癌细胞内雄激素受体的表达水平[6]，通过AR信号通路增强前列腺癌细胞的增殖及侵袭能力。尽管PCA3在前列腺癌内的特异性高表达已被熟知，对PCA3在前列腺癌中的调控机制作用尚未阐明。本研究在前列腺癌细胞LNCaP及C4-2内调节PCA3表达，发现沉默PCA3可减少AR及AR-V7的形成，从而抑制前列腺癌细胞增殖和迁移等恶性转变。
1 材料与方法
1.1 细胞系和细胞培养
人前列腺癌细胞LNCaP购自中国医学科学院基础所细胞中心，前列腺癌细胞C4-2为本实验室保存，使用RPMI1640培养基+10%胎牛血清，于37℃含5% CO2的恒温细胞培养箱内培养。
1.2 瞬时转染
siRNA由上海生工生物合成，靶向PCA3的siRNA（siPCA3）正义链5’CUAGCACACAGCAUGAUCAUU-ACGG3’，阴性对照序列Scrambled RNA（scrPCA3）正义链5’GCACGCUCCUACGAAUGCUAGUAAA3’，反义链均为互补。前列腺癌细胞使用siPCA3处理为siPCA3组，使用scrPCA3处理为scrPCA3组。转染前1 d接种前列腺癌细胞至6孔板，转染当天查看细胞贴壁生长良好后，按照Lipofectamine2000转染试剂盒说明书准备siRNA及脂质体的混合物，每孔加入5 μL脂质体及50 pmol的siRNA，终体积用无血清培养基加至2 mL。6 h后轻轻吸去培养基并更换含血清新鲜培养基继续培养30 h后收取样本，使用Trizol（美国Invitrogen公司）试剂盒提取总RNA反转录cDNA进行下一步实验。
1.3 实时定量PCR
使用SYBR绿荧光标记的SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒（Takara公司）及ABIPRISM7300Real-TimePCR仪进行实时定量PCR检测。按如下反应体系进行配置：2×SYBR Premix Ex TaqTM Buffer 10 μL，cDNA 模板50 ng，PCR上下游引物各0.8 μL，（終浓度0.4 μmol/L）;ROX Reference Dye（50x）0.4 μL，终体积为20 μL体系。特异性引物序列如下：PCA3 基因：上游：5’-AGATTTGTGTGGCTGCAGC-3’，下游：5’-TCCTGCCCATCCTTTAAGG -3’;内参GAPDH基因：上游：5’-TGACCCCTTCATTGACCTCA-3’，下游：5’-AGTCCTTCCACGATACCAAA-3’。反应条件为预变性95℃ 10 s，94℃ 5 s、55℃ 20 s、72℃ 31 s（共40个循环）。
1.4 Western blot
使用RIPA裂解液提取实验组细胞总蛋白，12000 r/min离心10 min后，将蛋白上清液转移至新EP管，BCA法测定蛋白浓度，加入上样缓冲液后煮沸5 min。聚丙烯酰胺凝胶电泳后转PVDF膜，5%脱脂奶粉TBST封闭1 h，分别加入1∶1000的兔抗人AR及AR-V7一抗（英国Abcam公司）4℃过夜，TBST洗3次，加入抗兔二抗（碧云天生物）孵育1 h，TBST洗膜3次后进行显发光。
1.5 MTT法检测细胞增殖
按照前述操作步骤进行siRNA转染操作后，消化重悬细胞，以每孔5×103的密度将细胞接种于96孔板。分别于0 h、24 h、48 h、72 h在各组选3个复孔更换新鲜培养基100 μL，并加入10 μL CCK-8试剂（日本同仁化学研究所），37℃孵育2 h后，酶标仪检测450 nm OD值并记录。
1.6 细胞迁移和侵袭
前列腺癌细胞接种至Transwell小室的上层，每孔1×104个细胞，加入1% FBS培养基 200 μL，Transwell小室下层加入600 μL含 10% FBS 的培养基。在37℃、5% CO2孵箱中培养24 h后，4%多聚甲醛固定10 min，随后用0.5%结晶紫染10 min。PBS清洗后棉签擦去上室中的细胞，随机选取5个视野对聚碳酯膜下表面的细胞进行拍照计数，取视野细胞数量进行统计学分析。进行细胞侵袭实验前在Transwell小室的上室内加入50 μL Matrigel基质胶（美国BD公司），放入37℃培养箱6 h，等待胶凝固后加入200 μL无血清培养基37℃培养箱30 min以水化基质胶，其余操作同迁移实验。
ntd 1.7 统计学处理
以上实验所获取的数据均使用SPSS 16.0软件进行统计学分析。计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，两组间差异采用t检验进行比较，每次实验至少重复3次，P<0.05为差异有统计学意义。
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