均匀设计法优化林下山参中人参皂苷提取工艺的研究
张艳欣1,2*朱国琴2王丹丹2**
（1. 上海中医药大学上海 201203；2. 上海上药杏灵科技药业股份有限公司上海 201703）
摘 要 目的：优选林下山参中人参皂苷的提取工艺。方法：以人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc和Rd的提取量以及HPLC谱峰个数为考察指标，对提取过程中甲醇体积分数、提取时间和提取温度进行考察，采用均匀设计法进行工艺优化。结果：筛选得到最优提取工艺条件为甲醇体积分数70%，提取温度50 ℃，提取时间100 min。在此条件下可使人参皂苷的提取量最高、谱峰个数最多。结论：所建立的优化工艺可大大提高提取效率，为林下山参人参皂苷的提取研究提供参考依据。
关键词林下山参 人参皂苷均匀设计
中图分类号：R284.2 文献标志码：A 文章编号：1006-1533(2019)15-0089-04
Optimization of extraction process of ginsenosides from mountain-cultivated ginseng
ZHANG Yanxin1,2*, ZHU Guoqin2, WANG Dandan2**
(1. Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China;
2. SPH Xing Ling Science & Technology Pharmaceutical Co., Ltd., Shanghai 201703, China)
ABSTRACT Objective: To optimize the extraction process of ginsenosides from mountain-cultivated ginseng. Methods: The extraction amount of ginsenoside Rg1, Re, Rb1, Rc and Rd and the number of HPLC peaks were taken as indicators, the methanol volume fraction, extraction time and extraction temperature in the extraction process were investigated, and finally the extraction process was optimized by the uniform design method. Results: The optimal extraction conditions were as follows: methanol volume fraction 70%, extraction temperature 50 ℃, extraction time 100 min. The highest amount of ginsenosides could be extracted and the more chromatographic peaks could be obtained under these conditions. Conclusion: The yields of ginsenosides can be greatly improved under the optimal condition and this method can provide a reference for extraction of ginsenosides from mountain-cultivated ginseng.
KEy WORDS mountain-cultivated ginseng; ginsenoside; uniform design
林下山参为五加科植物人参（Panax ginseng C.A.Mey.）的干燥根和根茎，是一味常见的名贵中药，《神农本草经》将其列为上品，认为其具有大补元气、复脉固脱、补脾益肺、安神益智等功效，在现代临床药理研究表明，人参能够在提升免疫力[1-2]、抗肿瘤[3-4]、改善心血管[5]、抗氧化[6]、抗衰老[7]、抗老年痴呆[8]、降血糖[9]、抑菌抗炎[10]等多个方面发挥显著作用，而其主要药效成分就是人参皂苷。
对于林下山参中人参皂苷的提取方法多有报道[11-13]，但未见采用均匀设计方法的相关研究。均匀设计是基于数论方法推导出来的一种实验设计方法，与试验次数等于实验因子数平方的正交设计实验相比，它的试验次数为最大水平数，大大减小了工作量。处理方法多采用多重现性回归的方法进行数据处理。本研究以《中国药典》2015版对林下山参含量测定限定成分和含量较多的成分人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc和Rd含量及谱峰个数为评价指标，以期反映林下山参总皂苷提取效率。采用均匀设计法考察甲醇体积分数、提取时间、提取温度对超声提取工艺的影响，并对提取效果进行验证，提高了提取效率，有利于特有微量成分的提取，提高林下山参利用率，为林下山参提取工艺提供参考。
*作者简介：张艳欣（1993—），女，硕士研究
生。研究方向：中药制药新技术及其产业化。E-mail: xiaotaotao9888@163
**通信作者：王丹丹（1979—），女，博士。研究方向：
中药学及药物化学研究。E-mail：wangdandan5656@126. com
1 材料与方法
1.1 仪器
HPLC液相系统：Waters Acquity ARC高效液相谱系统，配有Empover软件，四元溶剂系统、自动进样管理器、柱温箱、PDA 检测器；KQ5200DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；EYELA N-1100型旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）；EYELA CCA-1112型冷却水循环装置（上海爱朗仪器有限公司）；Sartorius BS 124S电子天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）；Sartorius SQPQUINTIX65-1CN 1/10分析天平［赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］。
1.2 试药
甲酸（分析纯，上海豪申化学试剂有限公司）；甲醇（谱纯，德国Merck公司）；乙腈（谱纯，德国Merck公司）；实验用水为娃哈哈纯净水。
实验用标准品：人参皂苷Rg1（批号Z1308L45576，含量以99.7%计），人参皂苷Re（批号B10M8S35243，含量以99.2%计），人参皂苷Rb1（批号Z16J9X52719，含量以99.9%计），人参皂苷Rc（批号M18J9S53098，含量以98.8%计），人参皂苷Rd（批号Z13N8X48155，含量以99.6%计），购自上海源叶生物科技有限公司。实验用林下山参粉末（批号150917）由上海上药神象健康药业有限公司提供。
1.3 方法
1.3.1 谱条件的建立
谱柱：Waters CORTECS C18（150 mm×4.6 mm，2.7 μm）；流动相A：0.1%甲酸水，流动相B：0.1%甲酸乙腈，梯度洗脱程序见表1；流速：1.0 ml/min；检测波长：203 nm；柱温：30 ℃；进样量5 μl。1.3.2 对照品溶液制备
取人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc及Rd对照品各5.0 mg，精密称定，至5 ml量瓶中，用甲醇溶解，定容，制得浓度为1 mg/ml的溶液，摇匀，即得。
1.3.3 供试品溶液制备
取林下山参粉末2.0 g，精密称定，置25 ml具塞锥形瓶中，加甲醇20.0 ml称重，于室温超声30 min，补足失重，过滤，取续滤液10.0 ml，旋转蒸发至干，置2 ml容量瓶中，用甲醇溶解定容，过0.22 μm滤膜，即得。
2 结果
2.1 线性关系考察
人参皂苷Rg1对照品20.0 mg、人参皂苷Re对照品20.0 mg、人参皂苷Rb1对照品20.0 mg、人参皂苷Rc对照品20.0 mg及人参皂苷Rd对照品10.0 mg，置5 ml容量瓶中，甲醇溶液溶解并定容，摇匀，得混合对照品母液，逐级稀释，得系列混合对照品溶液。在1.3.1项下谱条件进样，以对照品样品浓度（X）为
横坐标，峰面积（Y）为纵坐标进行回归（表2）。
2.2 方法专属性试验
取空白样品溶液、对照品溶液以及供试品溶液，按1.3.1项下谱条件进样，结果见图1。
A：样品溶液；B：对照品溶液；C：空白溶液
图1 林下山参HPLC谱图
表1 梯度洗脱程序
时间/min A/%B/% 08515 207525 376040 454060 492179
58 595
608515
表 2 各成分线性关系表
成分回归方程r线性范围/mg 人参皂苷Rg1Y=0.833 1X-245 5000.999 10.042~0.116人参皂苷Re Y=0.867
8X-215 4540.999 40.042~0.116人参皂苷Rb1Y=0.994 1X-161 6390.999 60.030~0.116人参皂苷Rc Y=0.883 5X-153 8940.999 80.030~0.116人参皂苷Rd Y=0.830 0X-103 988 1.000 0
0.034~0.080
2.3 精密度试验
取人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc及Rd混合对照品溶液，按1.3.1项下谱条件分别重复进样6次，结果人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc及Rd的含量RSD分别为0、0.55%、0.62%、0.64%、1.48%，表明仪器精密度良好。
2.4 稳定性试验
取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rb1对照品、人参皂苷Rc对照品及人参皂苷Rd 对照品混合对照品溶液，按1.3.1项下谱条件分别在0 h，2 h，4 h，6 h，8 h，12 h，24 h进样，结果人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc及Rd的含量RSD分别为0、0.49%、1.25%、1.11%、0.93%，表明供试品24 h时内稳定性良好。
2.5 重复性试验
精密称定同一批林下山参样品2.0 g，平行制备5份供试品溶液，按1.3.1项下谱条件测定，结果人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc及Rd含量的RSD值分别为：0、0.46%、2.23%、2.25%、1.08%。
2.6 加样回收率试验
分别精密称取已测含量的林下山参样品粉末2.0 g，共6份，分别按含量的50%、100%和150%量加入对应量对照品，按1.3.3项下供试品制备方法制备，每个加入量平行制备2份供试品溶液。测定含量，分别计算加样回收率及RSD值，得人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc及Rd 的平均加样回收率分别为：99.80%、101.23%、99.16%、100.51%、101.31%；RSD分别为1.41%、2.05%、1.30%、0.50%、1.96%。
3 林下山参提取方法及优化
3.1 提取方法的选择
精密称定同一批样品，共6份，2份按照《中国药典》2015版一部人参提取方法提取，2份超声30 min提取，2份超声后旋转蒸发至干用甲醇复溶后提取，以HPLC 谱图谱峰的数量及5种主要人参皂苷的含量为指标，发现超声提取后旋蒸蒸发浓缩至干用70%甲醇复溶提取效果最好，因此本实验选用该方法来优化林下山参中人参皂苷提取工艺。
3.2 单因素考察
为考察超声提取时间、提取温度和提取溶剂等因素对人参皂苷提取的影响，进行了单因素的试验考察，单因素结果最佳提取时间为60 min，最高得分为18.61分；单因素结果最佳提取温度为60 ℃，最高得分为19.78分；单因素结果最佳提取溶剂为70% MeOH，最高得分为23.08。结果根据实验结果现选定3个影响因素的取值范围：超声提取时间为20 min~140 min，提取温度为20 ℃~80 ℃，甲醇体积分数为40%~100%。
3.3 均匀设计实验安排及结果
将超声提取时间、提取温度和提取溶剂体积分数确定为3个因素，每个因素等分为7个水平，利用DPS设计均匀设计实验表并进行优化。各组分别加入不同体积分数甲醇，选取不同提取温度进行不同时间的提取，每个实验重复两次，实验安排及结果见表3。
表 3 实验设计与结果
水平X1：提取
时间/min
X2：提取
温度/°C
X3：甲醇体积
分数/%
谱峰
数目/个
人参皂苷含量/（mg·g-1）
Y：得分
Rg1Re Rb1Rc Rd
1 6070 4020 3.19 2.5
2 5.80 2.81 1.2116.4
3 212030 5023 4.42 3.69.0
4 4.40 2.0223.39
3 4020 8027 3.8
4 3.237.98 4.00 1.7922.07
4 2050 6028 4.06 3.378.37 4.13 1.8523.03 514060 9027 4.02 3.328.78 4.39 1.9723.39 610080 7028 4.33 3.589.69 4.83 2.1325.24 7 804010027 2.96 2.7山参
5 6.45 3.41 1.4919.06
3.4 数据分析
为同时兼顾谱峰数量与主要成分得率，采用综合评分法[14]，以包含各项指标加权系数的公式计算得到的每个实验的综合评分来作为考察均匀设计实验结果的指标。在该研究中，人参皂苷成分得率作为最
主要的目的，系数给予80%，谱峰数目也是提取物丰富度的一个重
要指标，系数给予20%。所以评分公式为：得分=谱峰个数×0.2+（人参皂苷Rg1含量+人参皂苷Re含量+人参皂苷Rb1含量+人参皂苷Rc含量+人参皂苷Rd含量）×0.8。
将表2得到的结果利用均匀设计处理软件（DPS 7.05版本）进行均匀设计回归分析，根据各回归项回归系数得到甲醇体积分数对实验结果影响最大，且得到回归方程：Y=-39.938+0.154X1+0.382X2+1.486X3-0.001X1×X1-0.004X2×X2-0.011X3×X3。显著水平P=
0.003，F=82 918.615，相关系数R=0.999，决定系数R2=
1.000，剩余标准差s=0.000 001 6，调整后的相关系数Ra=0.999。根据回归方程，得在提取时间为10
2.33 min、提取温度为48.32 ℃、提取溶剂为70.05%甲醇条件下，有最高分29.22。
根据实验结果，最终选定最佳超声提取条件为提取时间100 min，提取温度50 ℃，提取溶剂为70%甲醇。
3.5 均匀实验结果验证试验
取林下山参粉末2.0 g 3份，加入70%甲醇溶解，在50℃条件下提取100 min，计算得分分别为28.1、28.17和28.20，与均匀设计试验预测结果基本接近，表明该超声提取工艺稳定可行。
4 讨论
人参皂苷是林下山参主要活性成分之一，具有良好的药理作用和临床应用价值，价格昂贵，因此考察其最佳提取工艺很有意义。随着中药领域新技术的不断进步与发展，人参皂苷的提取工艺也逐步完善。相比传统的渗漉法、煎煮法等，超声提取具有节约时间、溶剂成本和效率高的特点，本实验在此基础上进行进一步的工艺优化。传统方法多采用正交设计进行优化[15]，其具有“整齐可比”特点[16]，但实验次数多，本实验采用具有“均匀分散”特点的均匀设计法[17]，相比正交优化最佳结果提取效果更佳，节约了药材及试剂等，提高了效率。但提取时间较长，且要进行温控处理，过程稍显繁琐。
对于林下山参谱条件的研究方面，前期考察了甲醇-水、乙腈-水等流动相体系，考察了甲酸、乙酸和磷酸等不同的流动相添加剂及不同酸度，考察了不同柱温以及洗脱梯度程序，最终确定林下山参谱条件。
经均匀设计之后的实验数据以二次多项式逐步回归方程进行分析，作为提取溶剂的甲醇的体积分数对提取结果起重要作用，选用合适的提取溶剂，大大提高了提取效率。且均匀设计验证结果与预测结果较为相近，表明该提取工艺稳定可行。
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（收稿日期：2019-05-24）
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