DNA分子遗传标记技术及其在人参药材鉴定中的应用
丁茜 M200975112
摘要 生药材鉴定中应用的DNA分子遗传标记技术（也称DNA分子遗传诊断技术）是利用任何生物种或个体都具有的特定DNA多态性，通过直接诊断分析DNA的多态性，避开遗传特性表现过程中的环境因素、数量性状遗传或部分与完全显性的干扰，快速准确地测定DNA的差异性。本文就近些年利用DNA分子遗传标记技术的发展及其在人参药材鉴定中的应用进展进行综述。
关键词 DNA分子遗传标记技术；人参药材鉴定；分子生药学
1 DNA分子遗传标记技术
DNA分子标记技术，也称DNA分子诊断技术，是指通过直接分析遗传物质的多态性来诊断生物内在基因排布规律及其外在性状表现规律的技术。DNA分子的信息量大，且不受外界因素和生物体发育阶段及器官组织差异的影响，即每一个体的任一细胞都含有相同的遗传信息，这就使其在生物鉴定方面具备了准确性高、重现性好等特点。近两年来，DNA分子标记技术在生
药材质量评价应用领域逐步扩大，方法也日趋完善。
1.1 限制性片段长度多态性分析技术(RFLP)
限制性片断长度多态性(Restriction FragmentLength Polymorphism,RFLP)是最早发展的分子标记,是由Bostein首先提出，Solle和Beckman最先应用于品种鉴别和品系纯度的测定，这是最早发展的分子标记技术。其基本原理是利用限制性内切酶酶切不同个体基因组DNA后，与同位素或非同位素探针标记杂交，从而显示与探针含同源顺序的酶切片段在长度上的差异。RFLP探针的来源主要是RG克隆和cDNA克隆，其中cDNA探针保守性较强，许多同科物种cDNA探针都可以作为通用探针。在实际应用过程中，人们普遍感到经典的RFLP技术须经酶切、电泳、South-ern转移、与探针杂交、放射自显影等步骤，在实际应用中很不方便，费时费力，并受到探针来源的限制，多态性检出效率低(只能检测探针长度内切酶识别位点上的变异)。同时要求的DNA量较大，实验材料必须新鲜，因此难以适用于干燥药材的鉴定，目前在中药鉴定领域已很少使用，已归为被淘汰的技术。在多源性中药材如伞形科北沙参、柴胡，菊科苍术属豆科甘草属，羽扇豆属(Lupinussp. )，YamazakiM，茄科澳茄属(Duborsias )MizukamiH，3种苍术MizukamiH的基原鉴定、资源分析及其地理品系(居)间亲缘关系研究方面有了一些报道。
1.2 聚合酶链式反应(PCR)
这是一种模拟自然DNA复制过程的体外酶促合成特异性核酸片断技术(又称无细胞分子克隆技术)，具有操作简单、快速、特异、灵敏的特点。由于生药材的加工和储藏过程极不利
于DNA的保存，采用传统的分子标记进行遗传分析十分困难，PCR的发明使分子标记技术有了突破性发展。PCR技术能对微量或高度降解的DNA样品进行分析，尤适用干燥药材中的DNA鉴别。该技术在中药研究领域有广泛应用。
1.3 PCR扩增的特定片段的限制性位点分析(PCR-RFLP)
PCR-RFLP集RFLP和PCR二者之长，先通过PCR扩增出1-1.5Kb以下的DNA片段，再经限制性内切酶消化，进行多态性酶切位点的分析，以达到鉴别的目的。吴平等[14]从5种海马干标本中提取DNA，用PCR技术扩增12SrRNA和细胞素b基因片段，对扩增产物进行了RFLP分析。用5种限制性内切酶消化，此方法可以鉴别其中2种海马。从研究中PCR-RFLP的结果可以看出，12SrRNA基因较细胞素b基因保守，从细胞素b基因片段的RFLP获得的遗传信息比从12SrRNA基因片段的大得多。故在用PCR-PFLP方法进行生药材的分子鉴定研究时，应选择进化速率较快的基因。
1.4 随机扩增片段长度多态性标记技术(RAPD)
RAPD技术(Random Amplified Polymor-phic DNA)是由美国的W illiams与Welsh两个研究小组于1990年同时提出的一种DNA分子标记技术。W illiams等称之为RAPD,Welsh等称之为AP-PCR ( arbitarilyprimed PCR)，此技术利用单一的10个碱基寡核苷酸作为引物，对基因组DNA进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳来检测DNA序列多态性。RAPD标记只需微量DNA，且对受试基因组无特定要求(不须知道受试基因DNA的背景材料)，检测灵敏、方便、多态性强，可以检测出RFLP标记不能检测的重复顺序，可填补RFLP图谱空缺，适用于种质资源的鉴定和分类、目标性状基因分子标记、遗传图谱的快速构建等研究，也可用于亲缘关系等的研究。相对于其他几种分子标记，RAPD标记是在生药材鉴定领域用得最多的分子遗传标记技术，并对生药材鉴定研究产生了深刻的影响。RAPD技术自问世以来，在生药材鉴定中主要用于生药材混淆品、代用品的鉴定，多来源生药材的鉴定，名贵生药材的鉴定，动物类生药材的鉴定等。
1.5 扩增片段长度多态性标记技术(AFLP)
AFLP技术(amplified fragment lengthpolymorphism)是1993年由荷兰科学家Zabeau和Vos发
展起来的一种检测DNA多态性的方法，AFLP是一种RFLP与RAPD相结合而又不使用分子杂交技术的分子标记手段，被誉为新一代的分子标记技术。它的原理是基于对基因组DNA双酶切经PCR扩增后的限制片段进行选择。其使用特定的双链接头与酶切DNA片段连接作为扩增反应的模板，用含有选择性碱基的引物对模板DNA进行扩增，选择性碱基的种类、数目和顺序决定了扩增片段的特殊性，所以，只有那些限制性位点侧翼的核苷酸与引物的选择性碱基相匹配的限制性片段才可以被扩增。扩增产物经放射性同位素标记、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后根据凝胶上的DNA指纹的有无来检出多态性。由于AFLP预先不需要知道DNA序列的情况，但获得的指纹信息位点要比RAPD技术更为丰富。相比之下，最后完成AFLP实验的成本比用RAPD方法的成本低，更省时间、更方便,而且准确性更高，数据更可靠，技术难度也不大。AFLP指纹技术具有稳定性高、重复性好等优点，能够得到清晰的AFLP指纹图谱，该体系具有良好的稳定性和重复性。
1.6 简单序列重复区间标记技术(ISSR)
ISSR技术( inter-simple sequencerepea)又称为锚定简单序列重复技术(anchoredsimplesequence repeat,ASSR)由加拿大蒙特利尔大学的Zietkiewicz等于1994年提
出。它用锚定的微卫星DNA为引物,即在SSR序列的3’端或5’端加上2~4个随机核苷酸，在PCR中，锚定引物可以引起特定位点退火，导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间DNA片段进行PCR扩增。所扩增interSSR区域的多个条带通过聚丙烯酰胺凝胶电泳或者琼脂糖凝胶电泳得以分辨，扩增带多为显性表。ISSR标记技术特点:实验操作简单、快速、高效，不需要繁琐地构建基因文库、杂交和同位素显示等步骤。ISSR标记技术结合了RAPD标记技术和SSR标记技术的优点,耗资少，模板DNA用量也少。
1.7 DNA序列分析技术
由于生药材的加工和储藏过程极不利于DNA的保存，因而采用上述DNA分子标记技术进行质量分析有一定的困难，而建立在PCR技术基础之上的DNA测序分析技术(DNAse-quencing)的开发使DNA分子标记技术取得了又一次的突破性进展。它是以DNA序列为核心的分子标记技术。动植物在进化过程中,其基因会发生碱基的重排、替代等,从而导致基因序列的差异。通过检测其DNA片段序列的差异,即可将不同的种区别开来。近年来，由于DNA测序技术的发展以及人们对一些基因结构、功能的进化规律认识的更加深入，一些基因已用于动植物的进化与分类、物种鉴别研究。利用已知基因的结构、序列，可以为PCR引物的设
计及目的基因的扩增提供前提条件。而基于PCR的DNA直接测序技术，极大地提高了DNA序列分析的效率，促进了该项技术的应用研究。
目前用于生药材DNA测序的基因主要有植物叶绿体基因组的rbcL，matK rpoC等；植物核基因组的rRNA、ITS等；动物线粒体基因组Cytb基因等；这些被选基因的共同特点是进化速率差异大，基因序列变异大，基因序列均匀地分布于整个基因组，分辨率高，一般用于种级以上的分类系统研究以及分析研究动植物的亲缘关系与进化等。
2 人参类药材的DNA分子鉴定
人参药材由于其药源紧缺稀少，采集困难，且疗效独特，经济价值相对较高，常有伪品出现。而且掺伪技巧越来越高，有时单凭传统的经验鉴别方法已难以辨别真伪，常规理化鉴别又存在着用样量大，操作复杂，专属性不强等缺点。采用DNA分子遗传标记技术可在一定程度上解决这些问题，从而保证人参药材质量及其临床疗效。
2.1人参及其易混淆品种的DNA分子鉴定
1994年，邵鹏柱等首次报道了采用AP-PCR方法对人参（Panax ginseng）和西洋参（P.q
uinquefolium）进行基源鉴别，采用20~27 mer的4个单引物利用AP-PCR指纹图谱分析技术鉴定出商品人参和西洋参[1]。次年，Shaw等又分离出人参属3种植物人参、西洋参、三七（P.notoginseng）和4种伪品包括桔梗（Platycodon grandiflorum）、紫茉莉（Mirabilis jalapa）、栌兰（Talinum paniculatum）、商陆（Phytolacca acinosa）的基因组DNA，分别采用10 mer的OPC25和OPC220两个单引物，利用RAPD标记明显地区分出人参属3种药材人参、西洋参、三七和4种伪品[2]。
1996年，Ozeki等应用RAPD法进行了人参属近缘药材以及人参制剂生药材品种的鉴别研究，对人参、西洋参和竹节参（P.japonicus）药材以及两种人参制剂：高丽红参袋泡茶和一种由人参组织培养物制成的茶剂中的基因组DNA进行提取，通过RAPD分析，发现人参干药材与人参的新鲜根毛组织能够产生相同的RAPD指纹图，人参、西洋参和竹节参之间采用不同的引物产生不同的RAPD指纹图，高丽红参茶因其为提取物不含模板DNA，几乎不出现DNA片段的扩增，而从人参组织培养物制成的茶剂中扩增到了与人参愈伤组织相同RAPD指纹的DNA片段[3]。
与此同时，Fushimi等和Ho等分别报道了DNA测序方法鉴别人参类药材。前者从人参、西
洋参、竹节参药材以及相关新鲜植物材料中分别提取到基因组DNA，然后利用18s rRNA基因片段的22 mer通用引物对18 SF和18 SR进行PCR扩增，结果得到了约1.8 kb片段的PCR产物。经DNA测序发现，3种人参属植物间的18s rRNA基因片段上第497、499、501和712号核苷酸序列不同，表明18s rRNA基因片段上500 bp左右位置上的核苷酸序列差异可作为一种基因标记用来鉴别人参及其相关药材[4]。Ho等从人参和西洋参药材中分别提取分离出重复DNA（repetitive DNA），通过p Bluescrip载体克隆并测序以作探针，采用限制性核酸内切酶Dra I酶解其基因组DNA，制成重复DNA指纹图谱，结果得到26个重复DNA序列，其中5个DNA指纹探针能够鉴别人参和西洋参[5]。其后，Fushimi等又报道了通过对18s RNA基因组测序，确定限制性内切酶位点，应用PCR-RFLP技术有效地鉴别了人参、西洋参和竹节参三种药材[6]。
1998年，马小军等建立了用毛细管PCR扩增人参和西洋参RAPD指纹的反应体系，采用毛细管PCR的方法，用引物OPO04扩增DNA指纹，发现人参与西洋参仅有2条共有条带，而西洋参具有4条特有条带，分别是790、630、590、370 bp。用另一引物OPF02扩增的结果是，人参与西洋参有4条共有带，西洋参有1条分子量为600 bp的特有带。毛细管PCR方法的特点是反应体系小，扩增DNA指纹较普通方法灵敏，仅用纳克级的样品量就可完成一次反应，
节省材料和试剂。但需要同时设立三蒸水对照组，通过比较消除污染造成的杂带[7]。
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