耳蜗细胞死亡方式的鉴别
耳蜗细胞死亡方式的鉴别
丁大连;;高可雷;蒋海燕;孙虹;陈成芳;Richard Salvi
lol英雄购买【摘 要】目的 通过几种不同耳毒物离体培养实验和活体动物实验,以观察耳蜗细胞死亡的不同方式.方法 应用Apoptosis-Necrosis Quantification Kit对正常或耳毒物处理过的离体培养耳蜗组织和活体耳蜗组织进行了染.试剂盒中含有3种不同荧光标记的探针,其中绿荧光标记的annexin V可鉴别活细胞内出现的凋亡改变,红荧光标记的Ethidium homodimer Ⅲ可鉴别活细胞内出现的坏死改变,蓝荧光标记的Hoechst 33342则可鉴别出健康细胞.结果 在耳蜗离体培养实验中,细胞凋亡信号和坏死信号几乎同时出现在顺铂或庆大霉素处理的耳蜗外植体;在活体动物实验中,细胞凋亡信号和坏死信号也同时出现在急性卡那霉素损害模型和慢性卡那霉素损害模型.结论 在细胞受损后的变性过程中,凋亡因子和坏死因子可同时出现而导致细胞的死亡.细胞凋亡的过程一般比较迅速而常常发生在急性损害阶段,而细胞坏死的过程往往比较缓慢而多见于细胞的慢性损害过程.在细胞死亡的最后阶段,细胞的最终破坏一般取决于哪种死亡方式抢先完成,但无论是哪种死亡方式占据了主导地位,都不能排除另外一种细胞死亡方式对细胞降解过程的协同作用.
【期刊名称】《中国耳鼻咽喉颅底外科杂志》
【年(卷),期】2015(021)003
【总页数】6页(P178-183)
【关键词】耳蜗;细胞凋亡;细胞坏死;细胞死亡;耳毒物
【作 者】丁大连;;高可雷;蒋海燕;孙虹;陈成芳;Richard Salvi
【作者单位】中南大学湘雅医院耳鼻咽喉头颈外科,湖南长沙410008;中山大学附属第三医院耳鼻咽喉头颈外科,广东广州 510630;Center for Hearing and Deafness,University at Buffalo,USA;中山大学附属第三医院耳鼻咽喉头颈外科,广东广州 510630;Center for Hearing and Deafness,University at Buffalo,USA;中南大学湘雅医院耳鼻咽喉头颈外科,湖南长沙410008;Center for Hearing and Deafness,University at Buffalo,USA;Center for Hearing and Deafness,University at Buffalo,USA;中南大学湘雅医院耳鼻咽喉头颈外科,湖南长沙410008;Center for Hearing and Deafness,University at Buffalo,USA;山东省立医院耳鼻咽喉科,山东济南250014;中南大学湘雅医院耳鼻咽喉头颈外科,湖南长沙410008;Cente
r for Hearing and Deafness,University at Buffalo,USA
【正文语种】什么牌子护肤品好中 文国旗头像怎么制作
【中图分类】R764
细胞的死亡方式主要可以分为两大类，一类是被称之为凋亡(apoptosis)的程序化死亡方式(programmed cell death);另一类是被称之为坏死(necrosis)的非程序化死亡方式(unprogrammed cell death)。近年来由Biotium 公司推出的新产品Apoptotic，Necrotic ＆ Healthy Cells Quantification Kit 可以同时鉴定正常细胞和凋亡细胞以及坏死细胞，本实验首次应用该检测方法观察了耳毒物引起的耳蜗组织细胞中出现的凋亡信号和坏死信号，发现在耳蜗细胞的病变过程中，实际上两种死亡方式即细胞凋亡和细胞坏死的信号均有不同程度表达，说明细胞在濒临死亡阶段的破坏方式并非简单的单一模式。现报道如下。
1 材料与方法
在Apoptotic，Necrotic ＆ Healthy Cells Quantification Kit 中含有3 种不同的荧光染料，它
们分别是绿荧光标记的可特异性显示细胞凋亡引起的外侧暴露磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine)的Annexin V、红荧光标记的可特异性显示细胞坏死引起的细胞膜屏障破裂的溴乙非啶同型二聚体III(Ethidium homodimer III)以及蓝荧光标记的可显示正常细胞DNA 的烟酸己可碱33342 (Hoechst 33342)荧光染料［1］。在细胞内部悄悄发生拆卸的凋亡过程往往首先造成细胞质膜表面小叶上磷脂发生改变，使位于其内部的磷脂酰丝氨酸被翻转到细胞质膜的表面。Annexin V 是一种能与翻转到质膜表面磷脂酰丝氨酸发生特异结合的35 kD 钙依赖磷脂蛋白(Ca2+-dependent phospholipids protein)，因此，绿荧光标记的Annexin V 一旦出现在病变细胞，则说明该受损细胞正处于细胞凋亡过程。损害因素造成的细胞坏死往往首先造成细胞质膜及其内膜系统的损害，这种破坏不仅改变了质膜和内膜系统的通透性，而且还会造成细胞质和细胞器的泄漏。Ethidium homodimer III 是一种不能进入正常细胞和凋亡细胞的带有高电荷的核酸探针(highly charged nucleic acid probe)，但是Ethidium homodimer III 却可以进入坏死细胞并将其标记成红荧光。该试剂盒还包含着可以穿越细胞屏障的蓝荧光标记DNA染料的Hoechst 33342，因此正常细胞可被该染料标记成蓝荧光。
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由于该试剂盒染方法只能标记活细胞，因此整个染标记过程必须在组织固定前完成。
将试剂盒提供的5X Binding buffer 稀释成1X Binding buffer，然后依次加入5 μl FITC-Annexin V、5 μl Ethidium homodimer III、5 μl Hoechst 33342，制备成探测液。
在耳蜗器官培养实验中，可将耳蜗组织直接移入探测液在37℃二氧化碳培养箱内作用60 min，经1X Binding buffer 充分漂洗后 再用10%福尔马林磷酸盐缓冲液固定数小时;在活体动物实验中，将麻醉动物的中耳腔打开并在蜗尖和蜗底各钻一小孔，然后将探测液从蜗底小孔灌入并经蜗尖小孔流出，保留耳蜗腔内的染液作用60 min，经1X Binding buffer 充分漂洗后 再用10%福尔马林磷酸盐缓冲液固定耳蜗，最后断头处死动物，取出颞骨浸入固定液继续固定数小时。在解剖显微镜下，常规取出耳蜗基底膜并制备成耳蜗基底膜铺片［2-3］。在共聚焦显微镜下，应用不同的激发光分别探测绿荧光标记的Annexin V 信号(λabc/λem =492/514 nm)和红荧光标记的Ethidium homodimer III 信号(λabc/λem=528/617 nm)以及蓝荧光标记的Hoechst 33342信号(λabc/λem =350/461 nm)。应用Confocal LSM Image Examiner 和Adobe Photoshop 5.5 软件系统对共聚焦图像资料进行不同图像层次和不同荧光信号的采集、合并及处理。
2 离体培养实验模型及其结果
将9 只出生3 d 的Sprague-Dawley 大鼠(Charles River Laboratories，Wilmington，MA)双侧耳蜗取出，常规制备成耳蜗基底膜培养样品［4-6］。耳蜗基底膜经预培养24 h 后，1/3 的样品(6 条耳蜗基底膜)用不含耳毒物的标准培养液继续培养24 h 作为正常对照组，另外1/3 的样品(6 条耳蜗基底膜)用含有50 μM 顺铂的培养液继续培养48 h 作为顺铂耳毒性实验组，剩下的1/3 样品(6 条耳蜗基底膜)用含有500 μM 庆大霉素的培养液继续培养24 h 作为庆大霉素耳毒性实验组。在终止实验之前，将耳蜗培养组织移入探测液染60 min，再用1X Binding buffer 充分漂洗后浸入10%福尔马林溶液固定3 h，最后移到载玻片上的甘油滴中，盖上盖玻片。正常对照组的耳蜗Corti 器细胞大都仅显示蓝荧光信号，偶见个别细胞中出现红坏死信号和绿凋亡信号(图1A)。经50 μM 顺铂处理48 h 的耳蜗Corti 器大都出现毛细胞的缺损，在Corti 器周围的残存支持细胞中可见红坏死信号和绿凋亡信号并存(图1B)。经500 μM 庆大霉素处理24 h的耳蜗Corti 器大都处于严重的病理改变状态，在变性的耳蜗毛细胞中同时显示红的坏死信号和绿的凋亡信号，内侧螺旋沟支持细胞中也出现红坏死信号和绿凋亡信号(图1C)。
图1 耳蜗器官培养实验的测试结果 A:正常对照组;B:顺铂耳毒性实验组;C:庆大霉素耳毒性实验组
3 急性耳中毒活体动物实验及其结果
将4 只成年雌性Sprague-Dawley 大鼠(Charles River Laboratories，Wilmington，MA)按照每公斤体重50 mg 的剂量静脉注射利尿酸钠，然后按照每公斤体重800 mg 的剂量立刻肌肉注射卡那霉素。受试动物在联合注射利尿酸钠和卡那霉素后24 h 施行活体耳蜗灌流探测液并作用60 min，经耳蜗灌流漂洗后再用10%福尔马林溶液灌流固定［7］。另取2 只同龄雌性Sprague-Dawley 大鼠的耳蜗基底膜做正常对照染。完成组织固定后，在解剖显微镜下分离取出全耳蜗基底膜并制备成耳蜗基底膜铺片，在共聚焦显微镜下观察［8］。正常对照耳蜗Corti 器细胞显示蓝荧光信号，偶见个别细胞中出现微弱的绿凋亡信号或红坏死信号(图2A ～D)。注射利尿酸钠和卡那霉素后24 h，耳蜗内外毛细胞中出现明显的绿凋亡信号和红坏死信号(图2E ～G)。将图2E ～G 合并后的耳蜗组织病现学图像可见耳蜗内外毛细胞中同时出现红荧光标记的坏死信号和绿荧光标记的凋亡信号(黄箭头标记)。
图2 卡那霉素引起的急性毛细胞损害测试结果 A:单纯探测蓝荧光信号的正常对照耳蜗切片样品;B:单纯探测绿荧光凋亡信号的正常对照耳蜗切片样品;C:单纯探测红荧光坏死信
号的正常对照耳蜗切片样品;D:将A、B 及C 合并后的正常对照耳蜗切片图像，说明在正常对照耳蜗样品中偶见微弱的红或绿荧光信号;E:注射卡那霉素和利尿酸钠后24 h，单纯探测蓝荧光信号的耳蜗切片样品;F:注射卡那霉素和利尿酸钠后24 h，单纯探测绿荧光标记凋亡信号的耳蜗切片样品(绿箭头标记);G:注射卡那霉素和利尿酸钠后24 h，单纯探测红荧光标记坏死信号的耳蜗切片样品(红箭头标记);H:将E、F 及G 合并后的耳蜗组织病理学图像
4 慢性耳中毒活体动物实验及其结果
按照每公斤体重800 mg 的剂量对5 只成年雌性Sprague-Dawley 大鼠肌肉注射卡那霉素，每天1 次，连续用药8 d。受试动物在连续用药的第9 天施行活体耳蜗灌流探测液并作用60 min，经耳蜗灌流漂洗后再用10%福尔马林溶液灌流固定。另取2 只同龄雌性Sprague-Dawley 大鼠的耳蜗基底膜做正常对照染。完成组织固定后，在解剖显微镜下分离取出全耳蜗基底膜并制备成耳蜗基底膜铺片，在共聚焦显微镜下观察。正常对照耳蜗 组织中偶见微弱的红坏死信号或绿凋亡信号(图3A ～D)。在连续注射卡那霉素8 d 的耳蜗毛细胞发现明显的绿凋亡信号和红坏死信号(图3E ～G)。将图3E ～F 合并后的耳蜗组织病理学
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图像可见大部分变性的耳蜗内外毛细胞中由于同时出现的红荧光标记的坏死信号和绿荧光标记的凋亡信号，其荧光信号被转变成黄(黄圆圈标记)，但也有一些外毛细胞仅出现红荧光标记的坏死信号(红箭头标记)或绿荧光标记(绿箭头标记)，黄圆圈标记说明坏死与凋亡并存，红者箭头指示细胞死亡以坏死方式为主，绿箭头指示细胞死亡以凋亡方式为主。
图3 卡那霉素引起的慢性毛细胞损害测试结果 A:单纯探测蓝荧光信号的正常对照耳蜗铺片样品;B:单纯单纯探测绿荧光凋亡信号的正常对照耳蜗铺片样品;C:单纯探测红荧光坏死信号的正常对照耳蜗样品;D:将A 和B 及C 合并后的正常对照耳蜗铺片图像，可见正常对照耳蜗样品中偶见微弱的红或绿荧光信号;E:连续注射卡那霉素8 d 后，单纯探测蓝荧光信号的耳蜗铺片样品;F:连续注射卡那霉素8 d 后，单纯探测绿荧光标记凋亡信号的耳蜗铺片样品(绿箭头标记);G:连续注射卡那霉素8 d 后，单纯探测红荧光标记坏死信号的耳蜗铺片样品(红箭头标记);H:将E、F 及G 合并后的耳蜗组织病理学图像
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