发酵玉米蛋白粉对犊牛生长、血液指标、瘤胃菌和营养物质消化的影响
发酵玉米蛋白粉对犊牛生长、血液指标、
瘤胃菌和营养物质消化的影响
姜鑫，崔梓琪，刘鑫，张立阳，刘帅，张永根*
（东北农业大学动物科学技术学院，哈尔滨
150030）
摘要：选取20头健康荷斯坦公犊，经两周适应期后，将犊牛按体重和日龄随机分为两组：①对照日粮组
（未处理基础日粮）；②FCGM 日粮组（50kg FCGM ·kg -1基础日粮；DM 基础），试验期42d 。结果表明，日粮中添加FCGM 显著（P <0.05）提高犊牛平均日增重和饲料效率；饲喂FCGM 犊牛血浆TP 、CAT 、T-SOD 、T-AOC 、IgA 和IgG 含量显著（P <0.05）增加，UN 和CHOL 含量显著降低（P <0.05）；试验组黄瘤胃球菌、白瘤胃球菌、栖瘤胃普雷沃氏菌、溶纤维丁酸弧菌和原虫相对丰度均显著（P <0.05）高于对照组；日粮中添加FCGM 显著（P <0.05）增加CP 和NDF 表观消化率。日粮中添加FCGM 可提高犊牛生长性能，改善血浆生化指标，提高犊牛抗氧化和免疫能力，调节瘤胃微生物菌结构，促进营养物质消化。
关键词：发酵玉米蛋白粉；犊牛；生长性能；血浆代谢；瘤胃微生物菌；营养物质消化率中图分类号：S823.8+5
文献标志码：A
文章编号：1005-9369（2019）02-0046-10英文版吻别歌词
姜鑫，崔梓琪，刘鑫，等.发酵玉米蛋白粉对犊牛生长、血液指标、瘤胃菌和营养物质消化的影响[J].东北农业大学学报,2019,50(2):46-55.DOI:10.19720/jki.issn.1005-9369.2019.2.0006
Jiang Xin,Cui Ziqi,Liu Xin,et al.Effect of fermented corn gluten meal on growth,blood indices,ruminal flora and nutrient di-gestibility in calves[J].Journal of Northeast Agricultural University,2019,50(2):46-55.(in Chinese with English abstract)DOI:10.19720/jki.issn.1005-9369.2019.2.0006早餐食谱大全图片
Effect of fermented corn gluten meal on growth,blood indices,ruminal flora and nutrient digestibility in calves/JIANG Xin,CUI Ziqi,LIU Xin,ZHANG
Liyang,LIU Shuai,ZHANG Yonggen(School of Animal Sciences and Technology,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)
Abstract:Twenty male Holstein calves were selected,after two week of adaptation,the calves
were blocked for body weight and age before being randomly assigned to 1of 2groups:①Control diet group (untreated basal diet),and ②FCGM diet group (50kg FCGM ·kg -1basal diet;DM basis)and then a 42-day feeding trial was conducted.The results showed that the dietary inclusion of FCGM significantly (P <0.05)increased the average daily gain and feed efficiency;calves fed FCGM diet significantly increased (P <0.05)plasma TP,CAT,T-SOD,T-AOC,IgA and IgG content,decreased (P <0.05)the concentrations of UN and CHOL;the relative abundance of Ruminococcus flavefaciens ,
收稿日期：2018-12-21
基金项目：国家奶牛产业技术体系（CARS-36）
作者简介：姜鑫（1993-），男，博士研究生，研究方向为反刍动物生产。E-mail:1925542917@qq *通讯作者：张永根，教授，博士，博士生导师，研究方向为反刍动物生产。E-mail:zhangyonggen@sina
Journal of Northeast Agricultural University
东北农业大学学报第50卷第2期50(2):46~552019年2月
February 2019
网络出版时间2019-3-816:45:20[URL]knski/kcms/detail/23.1391.S.20190308.1645.006.html
国内国际宠物托运玉米蛋白粉是工业生产玉米淀粉后主要副产品之一，蛋白质含量高，占干物质65%左右，含有淀粉、脂肪和纤维素等成分，氨基酸总量高于豆粕和鱼粉，代谢能高于玉米，广泛应用于饲料生产。但玉米蛋白粉中主要含有醇溶蛋白和谷蛋白，醇溶蛋白分子中存在大区域α-螺旋结构，疏水性较强，谷蛋白仅溶于碱水溶液，均为高憎水蛋白，水溶性差，氨基酸不平衡，在反刍动物体内不易消化吸收，对瘤胃微生物发酵和体结构的影响效果一般[1]。研究表明微生物固态发酵技术可提高玉米蛋白粉粗蛋白含量，平衡氨基酸组成，并产生肽类物质和益生菌，改善饲料适口性，提高玉米蛋白粉营养价值[2]。因此，利用微生物发酵玉米蛋白粉，应用于犊牛饲料，部分替代其他常用谷物蛋白原料，可解决豆粕等蛋白资源紧缺问题，对提高我国植物蛋白源利用率具有重要意义。
为获得优质发酵玉米蛋白粉（FCGM ）饲料，发酵菌种选择至关重要。本试验选取纳豆芽孢杆菌和乳酸菌作为发酵菌种，通过固态发酵获得FCGM 。纳豆芽孢杆菌可分泌高活性蛋白酶，酶解玉米蛋白中醇溶蛋白和谷蛋白，提高水溶性，产生具有抗氧化能力活性肽[3]。此外，纳豆芽孢杆菌还可提高犊牛生长性能、饲料利用率和免疫能力[4]。乳酸菌具有抑制有害菌生长和改善饲料适口性的特点，在饲料发酵中应用广泛。Bayatkouhsar 等研究表明乳酸菌可提高犊牛生长性能并降低犊牛腹泻率[5]。相关研究表明，FCGM 可提高奶牛瘤胃内部分纤维降解菌、蛋白降解菌、淀粉降解菌、真菌和原虫的相对丰如何在淘宝注册开店
度，降低产甲烷菌相对丰度，调节瘤胃微生物菌体结构，改善瘤胃发酵[6]，提高肉仔鸡抗氧化能力、生长性能并改善其肠道微生物环境[7]。Chu 等研究指出，发酵产品可提高犊牛生长性能、免疫能力和健康评分[8]。
FCGM 是一种优质功能性饲料，但日粮中添加
FCGM 对反刍动物影响研究鲜见报道。因此，本文通过犊牛饲喂试验研究日粮中添加5%FCGM 对断奶后犊牛生长性能、血浆代谢、瘤胃微生物菌和营养物质观消化的影响，旨在为FCGM 应用于犊牛生产提供理论参考。
1材料与方法
1.1
试验材料
玉米蛋白粉：购自哈尔滨大成生物科技有限公司。发酵菌种：纳豆芽孢杆菌（Bacillus subtilis ，CICC10262）和乳酸杆菌（Lactobacillus ，ACCC10637）购于中国工业微生物菌种保藏中心，分别接种于LB 和MRS 肉汤培养基中，于37℃恒温培养箱中培养至活菌数达到1×108cfu·mL -1，备用。FCGM ：玉
米蛋白粉作为培养基，料水比（W  V ）=3 2，以纳豆芽孢杆菌 乳酸杆菌比例2 3接种，接种量为5%（V/W ），为先接种纳豆芽孢杆菌，24h 后再接种乳酸杆菌，32℃发酵48h 得到FCGM ，4℃密封保存，备用。
1.2试验设计、动物和日粮
试验于2017年10~12月在东北农业大学实验
实习与示范中心（哈尔滨市阿城区）完成。根据《农业研究和教学-农业动物护理和使用指南》指导试验方案。
根据前期体外发酵试验确定FCGM 最优添加量为日粮的5%[6]，为进一步探讨FCGM 饲用价值，本研究选取20头健康荷斯坦公犊（平均值±标准误：日龄56.21±2.43d ；体重83.36±3.62kg ；50d 断奶），经两周适应期后，将犊牛按体重和日龄随机分为两个日粮组：①对照日粮组（未处理基础日粮）；②FCGM 日粮组（50kg FCGM ·kg -1基础日粮；DM 基础），开展42d 饲喂试验。参考美国
Ruminococcus albus ,Prevotella ruminicola ,Butyrivibrio fibrisolvens and Protozoa in trial group were higher than in control group;the dietary inclusion of FCGM also significantly increased (P <0.05)the apparent digestibility of CP and NDF.In conclusion,it indicated that the dietary inclusion of FCGM ele
vated the growth performance,improved plasma biochemical indicators,improved the immune and antioxidant capacity,regulated the structure of rumen microbial flora,and promoted the digestion of nutrients of calves.
Key words:fermented corn gluten meal;calf;growth performance;plasma metabolite;ruminal
microbial population;nutrient digestibility
姜鑫等：发酵玉米蛋白粉对犊牛生长、血液指标、瘤胃菌和营养物质消化的影响第2期·47·
NRC [9]（1996）生长犊牛营养需要，假设犊牛平均日增
重达1kg ，日粮配制。两组日粮等能等氮，且氨基
酸水平相似。日粮原料组成和营养水平见表1。试验期内，犊牛单栏饲养，自由采食饮水。
表1
日粮原料组成和营养水平（干物质基础）
Table 1
Ingredients composition and nutrient levels of diets (DM basis)
注：1每千克预混料包含：维生素A 15000IU ，维生素D 5000IU ，维生素E 50mg ，铁90mg ，铜12.5mg ，锰60mg ，锌100mg ，硒
0.3mg ，碘1.0mg ，钴0.5mg 。
2
关爱他人
根据美国NRC （1996）计算。
Note:1Premix provided per kg of concentrate:15000IU of vitamin A,5000IU of vitamin D,50mg of vitamin E,90mg of Fe,12.5mg of Cu,60mg
of Mn,100mg of Zn,0.3mg of Se,1.0mg of I,0.5mg of Co.
2
Calculated according to NRC (1996).
项目
Item
原料组成（g·kg -1）Ingredient composition
玉米Corn 苜蓿Alfalfa hay 豆粕Soybean meal 发酵玉米蛋白粉FCGM 菜籽粕Rapeseed meal 麦麸Wheat bran 棉籽粕Cottonseed meal 磷酸氢钙Calcium phosphate
食盐Salt 石灰Limestone 预混料Premix 1能值（mcal·kg -1）Energy values 2
代谢能ME 维持净能NEm 增重净能NEg 化学组成（g·kg -1）Chemical composition
干物质DM 粗蛋白CP 中性洗涤纤维NDF 酸性洗涤纤维ADF
钙Ca 磷P 赖氨酸Lysine 蛋氨酸Methionine 苏氨酸Threonine 异亮氨酸Isoleucine 亮氨酸Leucine 缬氨酸Valine
发酵玉米蛋白粉FCGM
-----------
---
656.00548.00104.0073.000.503.909.709.60
21.5017.5073.9026.90对照日粮Control diet
3371501200
10.002291151251210
2.671.791.25
843.10201.40237.60119.6011.007.109.172.877.006.89
14.519.00发酵玉米蛋白粉日粮
FCGM diet
350.90150
54.105010.002351111251210
2.661.781.23
830.90200.00236.30117.4010.807.008.643.026.966.92
15.079.00东北农业大学学报·48·第50卷
1.3样品采集、处理和测定
1.3.1生长性能和体尺测定
试验期第1天和第42天晨饲前分别测定犊牛体重，胸围，体高和体斜长，同时记录每头犊牛日采食量，计算犊牛平均日增重和饲料效率。1.3.2血浆样品采集和相关指标测定
试验期第0，21和42天晨饲前分别对空腹犊牛颈静脉采血，以肝素钠负压管收集血液15mL，3500g离心15min，将分离血浆用吸管吸出并置于1.5mL清洁离心管中，-20℃保存，待测。
血浆总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLB）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、胆固醇（CHOL）、尿素氮（UN）和葡萄糖（GLU）含量由哈尔滨市电力医院协助检测，试剂盒购于北京中生北控生物科技股份有限公司，测定仪器为AU680贝克曼库尔特生化分析仪[贝克曼库尔特商业企业（中国）有限公司，中国上海]。
根据试剂盒说明书，采用可见光法测定血浆过氧化氢酶（CAT）活性，羟胺法测定血浆总超氧化物歧
化酶（T-SOD）活性，血浆丙二醛（MDA）含量以硫代酸法测定，Fe3+还原法测定血浆总抗氧化能力（T-AOC）。试剂盒（货号：A007-1；A003-1；A001-1；A015-3）购自南京建成生物工程研究所。测定仪器为WFZ UV-2000紫外可见分光光度计（尤尼柯仪器有限公司，中国上海）。
血浆免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G （IgG）和免疫球蛋白M（IgM）含量由北京市华英生物技术研究所协助检测，测定方法为免疫比浊法，试剂盒（货号：HY-752）购自南京建成生物工程研究所，测定仪器为WFZ UV-2000紫外可见分光光度计（尤尼柯仪器有限公司，中国上海）。1.3.3瘤胃液采集和微生物菌测定
在试验第42天犊牛晨饲3h后，使用灭菌胃管采集瘤胃液，弃掉初始采集瘤胃液100mL以排除唾液影响，随后用四层纱布过滤剩余瘤胃液于清洁离心管中，-20℃保存。根据DNA试剂盒（欧米茄生物科技公司，美国）说明书，对瘤胃液提取总DNA。利用NanoDrop ND-1000分光光度计测定DNA浓度，确保D260nm和D280nm比值在1.6~1.8范围内。利用7500实时定量PCR仪检测瘤胃液总菌、产琥珀酸丝状杆菌、溶纤维丁酸弧菌、白和黄瘤胃球菌、淀粉降解菌、普雷沃氏菌、牛链球
菌、嗜淀粉瘤胃杆菌、栖瘤胃普雷沃氏菌和原虫相对丰度。荧光定量PCR扩增反应体系为20μL。反应程序为：95℃变性5s，60℃34s40个循环。引物序列见表2。根据测得Ct值，以总菌为基础，计算试验组目标菌相对于对照组丰度变化，公式如下：目标菌相对丰度[10]=2-ΔCt目标菌-ΔCt对照。
1.3.4粪样采集和表观消化率测定
试验第18~20和39~41天06:00和18:00采用直肠采粪法收集粪样，将每天2次采集粪样混合均匀，连续收集3d后，将粪样等比例混匀分成两份，一份硫酸固氮，-20℃保存至分析。两份粪样于65℃烘干72h，小型粉碎机粉碎后过40目筛制成待测样。加酸固氮粪样用于粗蛋白（CP）测定，其他粪样用于有机物（OM）、中性洗涤纤维（NDF）、酸性洗涤纤维（ADF）和不可降解中性洗涤纤维（iNDF）测定。其中，UDK159凯氏定氮仪（自动蒸馏滴定法）测定CP含量；根据AOAC[11]方法分析OM；参照文献[12]方法测定NDF，ADF和iNDF。日粮营养成分表观消化率以内源性指示剂（iNDF）法测定[13]。
1.4数据分析
Excel整理数据，使用UNIVARIATE程序检验数据正态分布。瘤胃微生物菌数量和营养物质表观消化率均用SAS9.1.2软件包中ANOVA过程分析；生长性能，体尺和血浆相关指标用SAS软件包中MIXED模型分析，其中试验第1天数据作为协变量。采用Turkey's作显著性检验，其中，P<0.05表示差异显著，P<0.01代表差异极显著，结果用平均值和标准误表示。
2结果与分析
2.1对犊牛生长性能和体尺的影响
由表3可知，饲喂FCGM日粮犊牛平均日增重（P=0.039）和饲料效率（P=0.036）均较对照组升高，且差异显著，但两组之间干物质采食量、体重、体高、胸围和体斜长均无显著变化（P>0.05）。
2.2对犊牛血浆生化指标的影响
如表4所示，试验第21天，试验组犊牛血浆CHOL含量（P=0.006）较对照组显著降低26.14%，而其他血浆生化指标无明显变化（P>0.05）；试验第42天，与饲喂对照日粮犊牛相比，饲喂FCGM日粮犊牛血浆TP（P=0.006）含量极显著提高7.35%，
姜鑫等：发酵玉米蛋白粉对犊牛生长、血液指标、瘤胃菌和营养物质消化的影响
第2期·49·
而血浆CHOL （P =0.025）和UN 含量（P =0.005）分别显著降低25.44%和14.21%，其他指标均无显著差异（P >0.05）。
2.3对犊牛血浆抗氧化指标的影响
由表5可知，试验第21天，饲喂FCGM 犊牛血
浆CAT （P =0.040）活性较对照组显著增加32.21%，
且血浆MDA （P =0.094）含量呈下降趋势，但两组犊牛T-SOD 和T-AOC 无显著差异（P >0.05）；试验第42天，试验组犊牛血浆总T-SOD （P =0.023），CAT
（P =0.030）和T-AOC （P =0.003）较对照组分别显著提高12.50%，33.89%和23.08%，MDA 含量无显著变化（P >0.05）。
表2
荧光定量PCR 引物序列
Table 2Primers used for RT-PCR detection of microbial species
项目
Item
总菌Total bacterial 普雷沃氏菌Prevotella 黄瘤胃球菌R.flavefaciens 白瘤胃球菌R.albus 原虫Protozoa
嗜淀粉瘤胃杆菌R.amylophilus 牛链球菌Streptococuus
产琥珀酸丝状杆菌F.succinogenes 溶纤维丁酸弧菌B.fibrisolvens 栖瘤胃普雷沃氏菌P.ruminicola
序列引物
Primer sequence/（5'→3'）
F ：GAAGAGTTTGATCATGGCTCA
G R ：CTGCTGCCTCCCGTAG
F ：GCGCCACTGACGCTGAA
G R ：CCCCAAATCCAAAAGGACTCAG
F ：CGAACGGAGATAATTTGAGTTTACTTAG
G R ：CGGTCTCTGTATGTTATGAGGTATTACC
F ：CCCTAAAAGCAGTCTTAGTTC
G R ：CCTCCTTGCGGTTAGAACA
F ：GCTTTCGWTGGTAGTGTATT R ：CTTGCCCTCYAATCGTWCT F ：CTGGGGAGCTGCCTGAAT R ：CATCTGAATGCGACTGGTTG
F ：TTCCTAGAGATAGGAAGTTTCTTCG
G R ：ATGATGGCAACTAACAATAGGGGT F ：GTTCGGAATTACTGGGCGTAAA R ：22CGCCTGCCCCTGAACTATC F ：ACCGCATAAGCGCACGGA
R ：CGGGTCCATCTTGTACCGATAAAT
F ：GCGAAAGTCGGATTAATGCTCTAT
G R ：CCCATCCTATAGCGGTAAACCTTTG
退火温度（℃）
T m
57.156.158.356.657.559.354.353.850.250.455.354.257.957.958.758.558.858.559.3
扩增片段大小（bp ）Amplicon size
352110132176234100127976578
表3FCGM 对犊牛生长性能的影响（n =201）
Table 3
Effects of dietary inclusion of FCGM on growth performance in calves (n =201)
项目
Item
体重（kg ）Body weight 体高（cm ）Withers height 胸围（cm ）Heart girth 体斜长（cm ）Body length 平均日增重（g·d -1）Average daily gain 干物质采食量（kg·d -1）Dry matter intake
玫瑰花的折法饲料效率Feed efficiency
组别Groups
对照Control 126.0106.4121.7107.2
766.0b 3.564.28b 试验Trial 129.1110.1122.1108.4
841.5a 3.614.64a 标准误
SEM 3.101.421.122.02
22.470.040.07P 值P -value 0.5040.0670.7920.7020.0390.2620.036
注：同行数据肩标不同小写字母代表差异显著（P <0.05），大写字母代表差异极显著（P <0.01），相同字母表示差异不显著（P >0.05）。1统计分析中使用的观察数。下同。
Note:Values in the same row with difference small letter superscripts mean significant difference (P <0.05)and difference capital letter superscripts
mean extremely significant difference (P <0.01),while with the same letter superscripts mean no significant difference (P >0.05).1The number of observa⁃tions used in the statistical analysis.The same as bellow.
东北农业大学学报·50·第50卷

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