红心火龙果不同发育时期果肉呈相关基因表达模式研究
红心火龙果不同发育时期果肉呈相关基因表达模式研究
作者：赵国文 贾瑞宗 郭静远 郭安平
来源：《热带作物学报》2021年第11期
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        摘 要：火龙果属于仙人掌科量天尺属，是具有重要经济和营养价值的热带水果之一，其果实富含花青素和甜菜红素。在果实成熟后期甜菜红素的大量积累引起红心火龙果果实转的现象。果肉泽是评价火龙果果实品质的重要指标之一，然而其果实转背后的基因表达调控模式并不清晰。深入研究火龙果果实发育过程中果肉颜调控的分子机理有助于丰富火龙果品质形成的理论基础。本研究以‘美红一号’红心火龙果为实验材料，采集果实发育过程中9个不同时期的样品，通过比较转录组学共识别了96种差异表达的基因，最后分析发现15个与素代谢通路相关的基因在果实发育不同阶段显著差异表达。GO功能富
集分析发现差异表达基因主要富集在与结合活性、催化活性、转运活性和结构分子活性相关的功能分类上，且与素代谢都有重要联系;KEGG代谢途径富集结果显示，次生代谢物合成途径、氨基酸和核酸代谢途径、酪氨酸代谢途径富集基因较多。利用实时荧光定量PCR技术对15个与素相关的差异表达基因进行了验证，其结果与转录组分析结果一致。生理分析和转录组分析结果表明，红皮红肉火龙果发育过程中伴随大量甜菜素的合成，且甜菜素合成途径中DODA基因逐渐上调，在果实转其中在P4时期明显的上升趋势，其它关键基因表达逐渐下调。本研究发掘火龙果中与果实转相关的相关基因，为后续火龙果遗传改良提供了重要的目标基因和遗传基础。
        关键词：火龙果;果实转;转录组测序;基因挖掘;
        中图分类号：S667.9 文献标识码：A
        Abstract： Pitaya belongs to the genus of Cactaceae and is one of the tropical fruits with important economic and nutri-tional value. Its fruits are rich in anthocyanins and betaine. In the late stage of fruit maturity， the accumulation of beta red pigment causes the phenomenon of red-hearted dragon fruit fruit color change. The color of the pulp is on
e of the important indicators to evaluate the quality of the dragon fruit. However， the gene expression regulation mode behind the color change of the fruit is unclear. In-depth study of the molecular mechanism of the color regulation of the pitaya fruit during the development of the dragon fruit will help to enrich the theoretical basis for the formation of pitaya quality. In this study， ‘Meihong No. 1’ red-hearted dragon fruit was used as the experimental material. Nine samples from different stages of fruit development were collected. A total of 96 differentially expressed genes were identified through comparative transcriptomics. Finally， 15 genes were found to be related to pigments. Genes related to metabolic pathways were significantly differentially expressed at different stages of fruit development. GO functional enrichment analysis found that differentially expressed genes were mainly enriched in functional classifications related to binding activity， catalytic activity， transport activity and structural molecule activity， and were importantly related to pigment metabolism. The results of KEGG metabolic pathway enrichment showed that there were many enriched genes in the biometabolite synthesis pathway， amino acid and nucleic acid metabolism pathway， and tyrosine metabolism
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pathway. Real-time fluorescent quantitative PCR technology was used to verify 15 the differentially expressed genes related to pigments， and the results were consistent with the results of transcriptome analysis. The results of physiological analysis and transcriptome analysis showed that the development of red skin and red flesh dragon fruit was accompanied by the synthesis of a large number of beet pigments， and the DODA gene in the beet pigment synthesis pathway was gradually up-regulated. During the fruit color change， there was an obvious upward trend in the P4 period. The expression of key genes is gradually down-regulated. This study explored the related genes related to fruit color change in dragon fruit， and provided an important target gene and genetic basis for subsequent genetic improvement of dragon fruit.
        Keywords： dragon fruit; fruit color conversion; transcriptome sequencing; gene mining
        DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.11.0012
        火龙果起源中美洲热带雨林地区，为仙人掌科量天尺属，果实外形独特，香甜多汁，
含有花青素和蛋白质等多种成分，营养价值较高深受消费者的喜爱[1-3]。火龙果原产地在中美洲的墨西哥、古巴等地区[4]，在我国火龙果的种植主要在南方的广西、福建、云南、海南等地进行种植[5]，为当地果农带来了良好的经济收益。红皮红肉（Hylocereus costaricensis）品种是一种新的改良品种[6]，其果实呈近圆形，鳞片粗短，反卷似“莲花座”，是火龙果的主要栽培品种[7]。目前，火龙果研究不仅在种植栽培、生物学特性、储藏保鲜等方面进行;同时也在火龙果分子生物学、细胞生物学、素提取[8-10]和植物病害[11-12]等方面取得了一定的进展。但火龙果基因组序列尚未报道，其分子生物学的研究仍受到较大限制。
        火龙果根据其果皮果肉颜分为红皮白肉、红皮红肉和黄皮白肉3种[13]。市场上常见的品种是红皮红肉和红皮白肉，红皮红肉更受到消费者喜爱。目前，火龙果素生物合成途径已基本明确，代谢途径中的关键酶也已克隆分离，但对素合成基因表达模式调控的研究还十分有限。因此，本研究以‘美红一号’红皮红肉火龙果为实验材料，进行转录组测序和后续分析，比较研究同一品种火龙果果肉在不同时期中基因的差异表达情况，对其进行相关的基因功能和代谢通路富集分析，筛选出差异表达基因，进一步对红肉火龙果中素的代谢差异进行初步分析。通过对筛选出的基因开展功能验证实验，可以为甜菜素合成
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        1 材料与方法
        1.1 材料
        ‘美红一号’红心火龙果（Hylocereus cos-taricensis）的P0：小花蕾;P1：中花蕾;P2：大花苞;P3：开花期;P4：膨大期;P5：破期;P6：着期;P7：果皮开始转期;P8：果实完全成熟期9个发育时期的果肉样品的和根、茎、花、果皮和果肉5个不同组织的样品。实验材料来自海南省昌江市火龙果种植基地，现场取样并用液氮进行速冻处理，每个个体设计3个生物学重复，总共42份样品，存于–80 ℃冰箱。
        1.2 方法
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        1.2.1 RNA提取与检测 将火龙果果实9个不同发育时期果肉组织和不同组织部位样品寄送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行基于IlluminaHiSeqTM2000的转录组测序。样品放入含有液氮的研钵成粉末，转入放有裂解液的EP管中，采用CTAB法提取RNA[14]。取适量样品进行检测，于–80 ℃保存。RNA提取流程与检测均委托生工生物工
程（上海）股份有限公司。
        1.2.2 文库构建和测序 使用SMRT Link的Iso-Seq protocol进行全长转录本分析，将最终得到的高质量全长转录本用于后续分析。火龙果果肉样品在PacBio Sequel平台上测序，建立PacBio IsO-Seq文库，获得原始聚合酶read序列，去除read序列，使用SMRT分析套件进行reads of insert（ROI）、分类、聚类和校正，最终得到高质量的全长共有序列。将每个库的高质量全长序列组合在一起，在没有参考基因组的情况下，使用LoRDEC软件利用Illumina二代数据对一致的转录本序列进行纠错，去除聚集和纠错的转录本。在PacBio RS sequel测序平台是基于单分子实时（SMRT）的测序技术，环状测序得到polymerase read。polymerase read中含有很多无效数据会对后续分析带来严重干扰，如测序接头序列，建库长度的偏差，以及测序错误、低质量碱基、未测出的碱基等情况，因此需通过一些手段将上述无效数据过滤掉，以保证分析的正常进行。最终得到有效的subreads插入片段。
        1.2.3 内参基因的选择 内参基因在各种组织和细胞中的表达量相对恒定，常作为检测基因表达水平变化的参考。其作用是校正上样量和上样过程中的实验误差，保证实验结果
的准确性。通过检测每个样品的内参量，可用于校正上样误差，使定量结果更加可靠。一般应选择在加工因子条件下表达不发生变化的基因作为内参。本研究选择TBP2作为内参基因（表1）。
       
        1.2.4 转录组数据的处理 测序后，对得到的所有原始数据（raw data）进行分析，过滤后得到clean data，然后去除无效的低质量序列。进行PacBio测序数据评估，最终得到有效的subreads inserts。使用SMRT Link的Iso-Seq protocol进行全长转录本分析，并使用最终的高质量全长转录本进行后续分析。基于Swissprot、Nr、KOG、GO和KEGG数据库，对所有转录本进行注释，包括表达注释和功能注释，最终富集分析。
        1.2.5 差异分析 用TPM方法计算转录本的表达水平。对于没有生物学重复的样本，先用TMM对read计数数据进行标准化，然后用DEGseq进行差异分析。为了获得显著差异的基因，设置筛选条件为：qValue<0.05和倍数差异|FoldChange|>2。显着差异表達转录本的GO和Pathway富集分析。智的组词
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        1.2.6 qRT-PCR验证 选择火龙果TBP2基因作为内参基因，通过转录组数据分析，结合KEGG数据库，筛选出甜菜途径中素相关转录因子、高表达基因和关键酶等15个unigenes进行qRT-PCR验证筛选。引物设计使用引物5.0（表1），使用TB Green（TliRNaseH Plus）（Takara）试剂盒，将样品放入实时荧光定量PCR仪（Mx3000P，Stratagene，美国）中完成反应，为防止技术失误，每个反应做3次重复，结果用相对定量法分析（2–CT）。

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