华北农学报·2010，
25（3）：235-238收稿日期：2010－04－25
基金项目：国家“973”计划（2009CB118902）；青岛市科技计划项目（09－1－3－63－jch ）
作者简介：初立良（1984－），男，山东蓬莱人，硕士，主要从事害虫生物防治的研究工作。通讯作者：李长友（1969－），男，黑龙江佳木斯人，教授，主要从事害虫生物防治研究。
两株杀鞘翅目害虫Bt 菌株的生物活性及杀虫蛋白基因鉴定
初立良，郑桂玲，周洪旭，李长友，李国勋
（青岛农业大学无脊椎动物细胞培养和细胞工程中心，山东青岛266109）
摘要：发掘对鞘翅目害虫具有活性的苏云金芽孢杆菌（Bt ）菌株和杀虫蛋白基因在生物防治中日益受到人们的重视。利用杀鞘翅目Bt 基因通用引物进行PCR 检测与生物测定相结合的方法，从山东省各地土壤
中分离的66株Bt 中筛选获得了两株对鞘翅目昆虫具有杀虫活性的菌株B-DLL 和B-JJX ，并采用SDS-PAGE 和PCR-RFLP 方法对其杀虫晶体蛋白和杀虫基因类型进行了鉴定。结果表明，菌株B-DLL 和B-JJX 对华北大黑鳃金龟1龄幼虫14d 的校正死亡率分别为86．7%和60．0%，对暗黑鳃金龟1龄幼虫14d 的校正死亡率分别为83．3%和76．7%，对柳蓝叶甲3龄幼虫5d 的校正死亡率分别为33．3%和46．7%。菌株B-DLL 的伴孢晶体呈圆形，B-JJX 的晶体为近方形，两株Bt 的伴孢晶体主要为130kDa 的蛋白，两株Bt 均含有新的cry8类基因，而不含cry1、
cry2、cry3、cry4/10和cry7等基因。关键词：苏云金芽孢杆菌；鞘翅目昆虫；杀虫活性；基因鉴定中图分类号：S433．4
文献标识码：A
文章编号：1000－7091（2010）03－0235－04
Identification of Insecticidal Protein Genes from Two Bacillus thuringiensis
Strains with Insecticidal Activity Against Coleopteran Larvae
CHU Li-liang ，ZHENG Gui-ling ，ZHOU Hong-xu ，LI Chang-you ，LI Guo-xun
（Advanced Invertebrate Cell Culture and Cell Engineering Center ，
Qingdao Agricultural University ，Qingdao 266109，China ）
Abstract ：The development of Bacillus thuringiensis （Bt ）strains and their insecticidal protein genes have played a significant role in biological control of insect pests．Based on PCR detection with special cry-gene primers and bioassay ，two Bt strains ，B-DLL and B-JJX ，with insecticidal activity against coleopteran larvae were screened from 66strains isola-ted from soil in Shandong Province of China．The expression of insecticidal crystal proteins and the types of cry gene of the two strains were identified with SDS-PAGE and PCR-RFLP method．Results showed that the B-DLL and B-JJX were toxic to the first instar larvae of Holotrichia oblita with the corrected mortality of 86．7%and 60．0%，to the first instar larvae of Holotrichia parallela with the corrected mortality of 83．3%and 76．7%，and to the third instar larvae of Pla-giodera versicolora with the corrected mortality of 33．3%and 46．7%，respectively．The B-DLL has parasporal crystal in-clusions with spherical shape whereas B-JJX has crystals with cuboidal morphology．Both strains expressed 130kDa pro-tein and contained novel cry8-type gene ，did not contain cry1，cry2，cry3，cry4/10and cry7genes．
Key words ：Bacillus thuringiensis ；Coleoptera ；Insecticidal activity ；Gene identification 苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis ，简称Bt ）自1901年问世以来，由于其杀虫晶体蛋白（In-secticidal
crystal proteins ，简称ICPs ）对目标害虫高效专一，对非靶标生物安全和对环境无污染，广泛用于防治农林、仓贮和卫生害虫，是目前国内外产量最
大、应用范围最广的微生物杀虫剂，其杀虫蛋白基因也是目前应用最为广泛和最有潜力的一类抗虫基因
［1］
。20世纪80年代以前，相关研究和应用大多
集中在对鳞翅目害虫的防治上，而对鞘翅目害虫的研究相对较少
［2］
。自1983年Krieg 分离了对鞘翅
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华北农学报25卷
目昆虫有活性的菌株拟步甲亚种（Bt subsp．tenebrio-nis ）以来［3］
，世界各地不断分离出对鞘翅目昆虫有
毒力的新菌株，如张书芳［4］
分离的C-001 006和ES-01等7个Bt 菌株对黄粉虫（Tenebrio molitor ）和
铜绿丽金龟（Anomala corpulenta ）具有不同的毒力，Ohba 等［5］
筛选获得了一株对多种金龟子幼虫具有
啤酒生产工艺流程特异杀虫活性的Bt 新菌株Buibui ，冯书亮等陈绮贞旅行的意义
［6］
分离
了对黄褐丽金龟（A．exoleta ）和铜绿丽金龟等具有杀
虫活性的Bt 分离株HBF-1以及Yu 等［7］
分离了对暗黑鳃金龟（Holotrichia parallela ）具有活性的菌株
Bt185。但目前成功防治鞘翅目害虫的Bt 菌株和产品数量还相对较少，鞘翅目害虫是粮食作物、经济作物、园艺和森林上的重要害虫，其危害不亚于鳞翅目害虫。如金龟子幼虫（俗称蛴螬）是一类重要的地下害虫，可危害粮食、棉花、油料作物、蔬菜、烟草、牧草、草坪等多种植物，寻安全高效的防治途径越来越受到人们的重视。因此，分离新的对鞘翅目害虫高效的Bt 菌株，并研究其杀虫蛋白基因，对于开发研制高效安全的生物杀虫剂和生产转基因植物等具有重要的理论和实践意义。本试验从山东省分离的Bt 菌株中进行筛选，获得两个对华北大黑鳃金龟（H．oblita ）、暗黑鳃金龟和柳蓝叶甲（Plagiodera ver-sicolora ）等鞘翅目昆虫具有杀虫活性的Bt 菌株B-DLL 和B-JJX ，并鉴定了其杀虫蛋白基因。
1
材料和方法
1．1
供试菌株
本实验室从山东省各地土壤中分离并保存的
66株Bt 菌株［8］
，其中菌株B-DLL 和B-JJX 为本试验筛选的对鞘翅目昆虫具有杀虫活性的菌株，标准
菌株HD-1为本实验室保存。1．2
试虫
华北大黑鳃金龟、暗黑鳃金龟和柳蓝叶甲等昆
虫是在青岛市城阳区田间采集的成虫，室内饲养后产卵，待幼虫孵化后，用天然饲料饲养，选择合适龄期的试虫供生物测定用。1．3
培养基和试剂
培养基为LB 培养基；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；限制性内切酶购自TaKaRa 公司；蛋白分子量标准、DNA 分子量标准、dNTPs 、Taq DNA 聚合酶等购自北京全式金生物技术有限公司；其他生化试剂均为市售分析纯。1．4Bt 菌株的培养和样品制备
将供试菌株接种到LB 平板上，
30ħ培养10 12h 后，转接到100mL 液体LB 培养基中，
30ħ摇床上200r /min 振荡培养，不同时间取样涂片，石炭
酸复红染后，显微镜下观察Bt 形态和晶体产生情况并拍照。待Bt 菌株芽孢和晶体分离后，10000r /min 离心10min 弃去上清液，用无菌水洗涤3次，
参照余子全等［9］
的方法制备蛋白样品，蛋白浓度测定按照Bradford 蛋白浓度测定试剂盒说明进行，保存于－20ħ，供生物测定用。1．5
Bt 菌株生物活性测定
对华北大黑鳃金龟和暗黑鳃金龟幼虫的活性测
定采用样品与灭菌土混合法，参照冯书亮等［6］
的方法；对柳蓝叶甲幼虫的活性测定采用浸叶法，参见张
杰等［10］
的方法。1．6
杀虫晶体蛋白SDS-PAGE 分析将Bt 菌株接种到LB 平板上，30ħ培养，待生长
多余的解释许嵩至芽孢和晶体分离后刮取菌落约100mg ，悬浮于
100μL 无菌水中，加入25μL 0．5mol /L NaOH ，室温下反应5min ，加入125μL 2ˑ样品缓冲液，混匀，
煮沸10min ，10000r /min 离心5min ，取上清进行
SDS-PAGE 分析，方法参照于涛等［8］
的方法。
1．7
杀虫蛋白基因PCR-RFLP 鉴定Bt 菌株接种于LB 液体培养基，30ħ培养过夜，
取1mL 培养液12000r /min 离心1min ，弃上清后
加入50μL 灭菌水悬浮，煮沸10min ，12000r /min 离心5min ，取上清作为PCR 反应的模板。PCR 反应体系为10ˑPCR Buffer 5μL ，
2．5mmol /L dNTPs 5μL ，10μmol /L 引物各1μL ，Taq DNA 聚合酶（5
U /μL ）0．5μL ，DNA 模板1μL ，加水至50μL 。PCR 反应条件为94ħ预变性5min ；94ħ变性1min ，54ħ退火1min ，72ħ延伸2min ，30个循环；72ħ延
伸10min 后，
10ħ保存。苏云金芽孢杆菌cry1基因的鉴定参照Kuo 等［11］
的方法，
cry2、cry3和cry4/10基因的鉴定参照宋福平等［12］
的方法，
cry7和cry8基因的鉴定参照Yu 等
［7］
的方法，采用1．5%的琼脂糖
凝胶电泳进行检测。
2
结果与分析
2．1
两株杀鞘翅目害虫Bt 菌株的筛选及生物活性
首先以本实验室在山东省各地土壤中分离的66
株Bt 菌株为材料，分别以杀鞘翅目昆虫的几类Bt 杀
虫蛋白基因cry3、
cry7和cry8类基因的通用引物S5un3/S3un3［12］、S5un7/S3un7和S5un8/S3un8［7］
进行PCR 扩增。结果表明，以S5un3/S3un3和S5un7/
S3un7引物扩增时，66株Bt 中均未出现目的条带，不含cry3和cry7类基因；在以S5un8/S3un8引物进行PCR 扩增时，其中两个菌株B-
DLL 和B-JJX 获得
3期初立良等：两株杀鞘翅目害虫Bt菌株的生物活性及杀虫蛋白基因鉴定
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了约1．2kb大小的目的扩增片段（图3），说明菌株B-DLL和B-JJX中可能含有杀鞘翅目昆虫的cry8类基因。
以无菌水为对照，测定了B-DLL和B-JJX菌株对三种鞘翅目昆虫的毒力（表1）。结果显示在浓度6．7μg/g（蛋白与土质量比）时，菌株B-DLL和B-JJX对华北大黑鳃金龟1龄幼虫14d的校正死亡率分别达到86．7%和60．0%，对暗黑鳃金龟1龄幼虫14d的校正死亡率分别为83．3%和76．7%；以6．7μg/mL的浓度浸叶喂食柳蓝叶甲，菌株B-DLL和B-JJX对其3龄幼虫5d的校正死亡率分别为33．3%和
46．7%。B-DLL和B-JJX两株Bt对鞘翅目金龟子总科的华北大黑鳃金龟、暗黑鳃金龟以及叶甲科的柳蓝叶甲等农林害虫具有不同程度的杀虫活性。
表1Bt菌株B-DLL和B-JJX对三种鞘翅目害虫的杀虫活性
Tab．1Insecticidal activity against three species of coleopteran insects from Bt strains B-DLL and B-JJX
菌株Strains 供试昆虫
Insects
龄期
Instar
供试虫数/头
Insect number
校正死亡率/%
Corrected mortality
3d5d7d14d
B-DLL华北大黑鳃金龟Holotrichia oblita130－－86．786．7暗黑鳃金龟Holotrichia parallela130－－80．083．3
柳蓝叶甲Plagiodera versicolora33030．033．3－－B-JJX华北大黑鳃金龟Holotrichia oblita130－－53．360．0暗黑鳃金龟Holotrichia parallela130－－73．376．7
柳蓝叶甲Plagiodera versicolora33043．346．7－－注：－．为未调查Note：－．Not tested．
2．2两株Bt菌株的形态
两株Bt菌株的营养体均呈杆状，单个或成链状生长。在LB平板上30ħ条件下培养3d，芽孢和伴孢晶体形成，两株Bt的芽孢均为椭圆形，菌株B-DLL的伴孢晶体形状多为圆形，且大小不均匀，而菌株B-JJX产生近方形的伴孢晶体（图1）。
图1Bt菌株B-DLL（左）和
B-JJX（右）的芽孢（S）以及伴孢晶体（C）形态
Fig．1Micrograph of spore（S）and parasporal
crystal（C）from Bacillus thuringiensis
strains B-DLL（left）and B-JJX（right）
2．3两株Bt杀虫晶体蛋白的SDS-PAGE分析以标准菌株HD-1为对照，对菌株B-DLL和B-JJX的晶体蛋白进行SDS-PAGE分析（图2），结果表明，菌株B-DLL和B-JJX的晶体蛋白主要为130 kDa的蛋白，而HD-1菌株含有130kDa和60kDa 两种类型的蛋白。
2．4杀虫蛋白基因鉴定结果
PCR-RFLP基因鉴定结果表明，B-DLL和B-JJX 两株Bt均不含cry1、cry2、cry3、cry4/10和cry7等基因。利用cry8类基因的通用引物S5un8/S3un8进行PCR扩增，结果表明B-DLL和B-JJX
菌株可以扩
1．蛋白分子量标准（200，116，97．2，66，44．3kDa）；
2．HD-1；3．B-DLL；4．B-JJX。
1．Protein molecular weight marker（200，116，97．2，66，44．3kDa）；
2．HD-1；3．B-DLL；4．B-JJX．
春节假期2023年图2Bt菌株晶体蛋白的SDS-PAGE分析
Fig．2SDS-PAGE analysis of insecticidal
crystal proteins from Bt
strains
1．DL2000（2000，1000，750，500，250，100bps）；2．B-DLL PCR产物；3．B-JJX PCR产物；4．Eco O109I和Dra I酶切B-DLL PCR产物；5．Eco O109I和Dra I酶切B-JJX PCR产物。
1．DL2000Marker（2000，1000，750，500，250，100bps）；2．B-DLL PCR prod-ucts；3．B-JJX PCR products；4．B-DLL PCR products digested with Eco O109I and Dra I；5．B-JJX PCR products digested with Eco O109I and Dra I．
图3Bt菌株B-DLL和B-JJX cry8基因的PCR-RFLP鉴定Fig．3PCR-RFLP analysis of cry8-type
gene from Bt strains B-DLL and B-JJX
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增出1．2kb的目的片段（图3），说明菌株B-DLL和
B-JJX中可能含有cry8类基因。对PCR产物用Dra
Ⅰ和Eco O109Ⅰ两种限制性内切酶进行消化，酶切产物
经电泳检测后发现，PCR扩增片段未能被上述两种限
制性内切酶消化（图3），根据已公布的几种cry8基因
序列和PCR-RFLP鉴定体系（表2），B-DLL和B-JJX
两株Bt的PCR-RFLP酶切图谱与表2中所列的几种
cry8类基因均不相同，推测可能含有其他不同的cry8
类基因。目前，已从B-DLL菌株中克隆了cry8Ea2基
因［13］，从B-JJX菌株中克隆了cry8Ab1基因，新基因
的克隆也支持了基因鉴定的结果。
表2cry8类基因的PCR扩增产物和限制性酶切长度多态性
Tab．2The size of PCR amplified products
and their restriction fragments of cry8genes
基因Genes PCR扩增产
物/bp快乐出发歌词
PCR
products
Eco O109I和
Dra I酶切片段/bps
Restriction fragments
digested with Eco O109I and Dra I
cry8Aa1194197，442，555
cry8Ba1194639，555
小产权房屋买卖协议cry8Bb1194639，555
cry8Bc1194639，555
cry8Ca1212197，92，310，613
cry8Da1212197，92，310，613
3讨论
研究表明，Bt菌株中杀虫晶体蛋白起主要杀虫作用，杀虫晶体蛋白由cry基因编码［1］。因此，对Bt cry基因型的鉴定，可以预测菌株的杀虫活性，本研究以对鞘翅目具有活性的cry3、cry7和cry8基因通用引物首先对大量菌株进行基因型的初步鉴定，然后有针对性地进行生物活性的测定，获得了两株对几种鞘翅目农林害虫有活性的Bt菌株，相对于直接通过生物测定筛选，大大减少了工作量，同时也证明了Bt cry基因型和杀虫活性之间的对应关系。本研究首次报道了Bt菌株B-DLL和B-JJX对我国主要地下害虫华北大黑鳃金龟幼虫具有较高的活性，同时对暗黑鳃金龟幼虫也具有较好的杀虫效果，为蛴螬类害虫的生物防治提供了新的Bt菌株资源。
近年对杀鞘翅目昆虫，特别是蛴螬类害虫Bt菌株的分离和新基因的发掘倍受人们的重视，目前已发现了二十多个对蛴螬类害虫有活性的cry8类杀虫蛋白基因，有些杀虫蛋白基因已经开始用于生物杀虫剂的开发和转基因植物的研究，显示出了巨大的应用潜力和广阔的应用前景［14－16］。本研究筛选的两株Bt菌株B-DLL和B-JJX对华北大黑鳃金龟、暗黑鳃金龟以及柳蓝叶甲等多种鞘翅目害虫具有杀虫活性，并已从中克隆了2个杀虫蛋白基因，更多基因的克隆以及杀虫活性的研究正在进行中。这些菌株和基因的研究将为转基因植物的生产以及工程菌的构建提供新资源和理论依据。
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