两种新型冠状病毒核酸试剂检测结果的对比研究
·论著·
基金项目：国家结核病临床医学研究中心立项课题（2020B1111340028）通信作者：张明霞，E-mail：zmxmby ＠outlook
引用格式：蔡侃儒，张洁云，彭亚柏，等.两种新型冠状病毒核酸试剂检测结果的对比研究[J].新发传染病电子杂志，2021，6（1）：18-21.
Cai Kanru, Zhang Jieyun, Peng Yabo, et al.Comparison of two state-of-the-art assays for detecting 2019-nCoV nucleic acid[J].Electronic Journal of Emerging Infectious Diseases,2021,6(1):18-21.
蔡侃儒，张洁云，彭亚柏，程文兵，张明霞（深圳市第三人民医院肝病研究所，广东 深圳 518000）
两种新型冠状病毒核酸试剂检测结果的对比研究
  【摘要】目的 比较两种新型冠状病毒核酸试剂检测结果的一致性。方法 回顾性分析深圳市第三人民医院确诊新型冠状病毒患者痰标本、鼻拭子标本和肛拭子标本共计539份核酸检测结果，采用一致性检验进行统计分析。并从两种试剂检测的核酸Ct值均＞36的样本中随机抽取4份进行测序验证。结果 两种试剂对痰标本、鼻拭子标本和肛拭子标本一致性检验结果（Kappa值）分别为0.49、0.55和0.71。核酸Ct值＜34时，两种试剂在3种标本中阳性一致率均为100%；核酸Ct值≥34时，3种类型标本中2种试剂阳性
一致率分别为0、45.0%和57.1%。测序结果证实两种试剂检测核酸Ct值均＞36的4份样本中含有新型冠状病毒核酸。结论 两种新型冠状病毒核酸试剂在核酸Ct值较高时(≥34)，检测结果一致性较差，使用任一试剂检测都存在假阴性的风险。建议有条件的实验室可使用两种试剂平行检测以提高准确度，未来亟需进一步优化这两种试剂的检测性能。  【关键词】新型冠状病毒；核酸检测；一致性检验；测序    DOI：10.19871/jki.xfcrbzz.2021.01.004
Compar i son of two state-of-the-art assays for detect i ng 2019-nCo V nuc l e i c ac i d
Cai Kanru, Zhang Jieyun, Peng Yabo, Cheng Wenbing, Zhang Mingxia (Institute of Hepatology, Shenzhen
Third People's Hospital, Guangdong Shenzhen 518000, China)
  【Abstract】 Objective To investigate the consistency of the two assays for the testing of 2019-nCoV nucleic acid. Methods  2019-nCoV nucleic acid were parallelly tested in sputum, anal swabs and nasal swabs from COVID-19 confirmed cases by A assays and B assay in the third people's hospital of Shenzhen. 539 results were retrospectively analyzed using consistency test. Four samples with Ct value ＞36 parallelly tested by two assay were selected for sequencing. Results  The Kappa values of nucleic acid results from the two assay were 0.49 in sputum, 0.55 in nasal swa
bs, and 0.71 in anal swabs, respectively.The consistency rates for the nucleic acid in sputum, nasal swabs, and anal swabs were 100% when the Ct values were ＜34 parallelly tested by two assay. While, the corresponding consistency rates were 0% in sputum, 45% in nasal swabs, and 57.1% in anal swabs, respectively, when the Ct values were ≥ 34 parallelly tested by two assay. Nucleic acid was tested positively by sequence in the four samples with Ct values ＞36 parallelly tested by two assay. Conclusions  The consistency of nucleic acid results tested by the two assays was low when Ct value was high (≥34), which implies that using single assay of them has the risk of false-negative. Parallelly testing the nucleic acid of 2019-nCoV is an alternative to increase testing accuracy. It is urgent to optimize the efficacy for the two assays.
  【Key words】 2019-nCoV; Nucleic acid; Consistency test; Sequence
  新型冠状病毒肺炎传播迅速，严重影响到人类的生命安全和社会经济的发展。通过高通量测序证实，引起新型冠状病毒肺炎的新型冠状病毒病原学为一种新型β属冠状病毒[1]。新型冠状病毒检测的方法学分为病原学检测（如基因测序、RT-qPCR）和血
清学抗体检测[2-6]。目前，因RT-qPCR具有特异性高、操作简单和检测快速等优势，被推荐为常规检测方法。国家卫生健康委员会发布的《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南（第五版）》规定实验室确认阳性病例，需满足同一份标本中新型冠状病毒的
红烧鸡ORF1ab及N基因2个靶标RT-qPCR检测结果均为阳性，或单靶标阳性患者重新采样或同一时间采集另一种类型样本检测结果也为单靶标阳性[7]。受疫情突发影响及应急控制的需要，目前国内常用的RT-qPCR检测试剂从研发到投入使用周期较短，没有经过临床大数据对比试验，实际检测工作中假阳性或假阴性结果较常出现，为疾病诊断带来了困惑，也为疫情防控带来了较大的不确定性[8,9]。本研究对新型冠状病毒肺炎确诊患者的痰标本、鼻拭子标本和肛拭子标本使用两种RT-qPCR试剂平行检测，现将两种试剂检测结果对比报道如下。
1 资料与方法
1.1 研究对象  回顾性分析深圳市第三人民医院确诊新型冠状病毒患者2020年2月17日至25日多种类型标本的核酸检测结果。收集痰标本119份、鼻拭子标本228份、肛拭子标本192份，3种类型标本共计539份核酸检测结果。
1.2 方法
1.2.1 核酸检测试剂  A试剂（规格：48人份/盒，达安基因有限公司，广州）、B试剂（规格：50人份/盒，上海伯杰医疗科技有限公司，上海）均是采用实时荧光PCR技术，以新型冠状病毒的ORF1ab、N基因设计特异性引物和TaqMan探针，通过荧光定量PCR仪进行扩增，从而实现对新型冠状病毒核酸的检测。A试剂的分析灵敏度为500copies/ml，B试剂的分析灵敏度为1000copies/ml。
西安旅游景点图片1.2.2 核酸提取方法与扩增仪器  采用深圳华因生物核酸提取和纯化试剂盒提取核酸。采用ABI 7500 PCR 仪设置反应程序，用A和B试剂平行扩增检测。
1.2.3 核酸测序试剂与仪器ABI测序配套试剂和ABI3730xl DNA Analyzer基因测序仪。
1.2.4 结果判读  A试剂判读标准：检测样本在FAM和VIC通道无扩增曲线或Ct值＞40，且Cy5（内标通道）有明显扩增曲线，结果判为阴性。检测样本在FAM和VIC通道Ct值≤40，且有明显的扩增曲线，结果判为阳性。检测样本仅在FAM或VIC单一通道Ct值≤40，另一通道无扩增曲线，结果需要复查，复查结果一致，判为可疑，复检结果阴性，判为阴性。
  B试剂判读标准：检测样本在FAM和VIC通道无Ct 值或Ct值＞38，且ROX（内标通道）Ct值≤38，结果判为阴性。检测样本在FAM和VIC通道Ct值≤38，且ROX（内标通道）Ct值≤38，结果判为阳性。检测样本仅在FAM或VIC单一通道Ct值≤38，另一通道无扩增曲线，结果需要复检，复检结果一致，判为可疑，复检结果阴性，判为阴性。
1.3 统计学方法应用SAS 9.3进行数据分析，采用Kappa检验评价两种试剂检测结果的一致性。Kappa ≥0.75代表两者一致性较好，0.75＞Kappa≥0.4代表两者一致性一般，Kappa＜0.4代表一致性较差。
2 结果
2.1 不同类型标本A试剂和B试剂检测结果的一致性比对 本次研究收集的539份标本中，119份痰标本，A 试剂检出阳性标本17份（17/119，14.3%），B试剂检出阳性标本7份（7/119，5.9%），两种试剂一致性一般（Kappa=0.49）（表1）。228份鼻拭子标本，A试剂检出阳性标本27份（27/228，11.8%），B试剂检出阳性标本16份（16/228，7.0%），两种试剂一致性一般（Kappa=0.55）（表2）。192份肛拭子标本，A试剂检出阳性标本21份（21/192，10.9%），B试剂检出阳性标本15份（15/192，7.8%），两种试剂一致性一般（Kappa=0.71）（表3）。
2.2 不同标本核酸检测结果Ct值的阳性一致性与测序验证  根据核酸Ct值水平分组比较两种试剂检测阳性一致性，结果显示，当核酸Ct值＜34时，痰、鼻拭子、肛拭子三种标本中二者阳性一致性均为100%；核酸Ct值＞34时，痰、鼻拭子和肛拭子标本中二者阳性一致性分别为0、45.0%和57.1%（表4）。为了进一步证实两种试剂检测均为低病毒载量时，但检测结果不完全一致的样本是否含有新型冠状病毒，本研究从两
痰标本
B试剂
阳性可疑阴性合计
A试剂
阳性710017
可疑081523
阴性027779
合计72092119表1 痰标本A试剂和B试剂的检测结果比对（份）
注：Kappa=0.49。
痰标本
B试剂
阳性可疑阴性合计
A试剂
阳性1611027
可疑091827
阴性08166174
合计1628184228表2 鼻拭子标本A试剂和B试剂的检测结果比对（份）
注：Kappa=0.55。
痰标本
B试剂
阳性可疑阴性合计
A试剂
女人是老虎歌词
阳性156021
可疑0279
2020年放假阴性01161162
合计159168192表3 肛拭子标本A试剂和B试剂的检测结果比对（份）
注：Kappa=0.71。
种试剂检测的核酸Ct值均＞36的样本中随机抽取4份样本进行测序验证（表5）。选取了N基因的一个片段2分别进行测序（图1）。结果显示，4份样本N基
因的均测序成功，并且序列与已知病毒序列相符合  （图2）。3 讨论
  国家卫生健康委员会发布的《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南（第五版）》明确核酸检测样本类型包括4种：一是上呼吸道样本，包含鼻咽拭子和咽拭子等；二是下呼吸道样本，包含深咳痰液、支气管灌洗液、肺泡灌洗液和呼吸道吸取物等；三是大便标本，包含粪便及肛拭子；四是全血样  本[7]。因咽拭子和血标本阳性检出率低，支气管灌洗液和肺泡灌洗液等不容易采集，实际工作中一般常采集痰、鼻拭子、肛拭子这三种类型的标本进行新型冠状病毒核酸检测。本研究常规采用国内两种试剂对上述3种类型标本进行平行检测，但实际工作中两种试剂检测结果不一致的情况较常出现。故本研究通过两种试剂检测结果对比为改善试剂性能提供数据支持，对提高新型冠状病毒肺炎诊断的准确性及疫情防控具有重要的临床价值和公共卫生指导意义。
  本研究发现，在病毒载量较高（核酸Ct值＜34）时，两种试剂在痰、鼻拭子和肛拭子标本中的阳性检出率完全一致。这提示对于病毒含量比较高的样本，两种试剂检测结果无差异。当病毒载量较低（核酸Ct 值＞34）时，在痰、鼻拭子和肛拭子这三种类型的标本中，两种试剂检测结果一致性一般，存在A试剂阳性和B试剂可疑，A试剂可疑和B试剂阴性，A试剂阴性
标本(N/ORF1ab)Ct值A试剂B试剂阳性一致性（%）例数检测结果例数检测结果
痰26＜Ct值＜305阳性5阳性100痰30＜Ct值＜342阳性2阳性
100痰34＜Ct值＜4010阳性0/10阳性/可疑0鼻拭子26＜Ct值＜303阳性4阳性100鼻拭子30＜Ct值＜344阳性3阳性
100鼻拭子34＜Ct值＜4020阳性9/11阳性/可疑45.0肛拭子26＜Ct值＜303阳性3阳性100肛拭子30＜Ct值＜344阳性4阳性
100肛拭子
34＜Ct值＜40
14
阳性
8/6
阳性/可疑
57.1
表4 不同标本核酸检测结果Ct值的阳性一致性
试剂
样品编号RT-qPCR结果Ct值
N基因ORF1ab基因A试剂
1阳性36.6439.012阳性36.8638.773可疑38.99≥40.004阴性≥40.00≥40.00B试剂
1可疑36.77≥38.002阳性36.3037.603阴性≥38.00≥38.004
可疑
37.50
≥38.00
表5 测序低病毒载量标本的Ct值比对
图1 N基因测序片段示意图
图2  4份样本N基因的fragment2测序比对结果
和B试剂可疑这三种结果不一致的情况。这可能与两个厂家试剂盒的灵敏度不同有关，A试剂的灵敏度为500copies/ml，B试剂的灵敏度为1000copies/ml，根据中国食品药品检定研究院提供的新型冠状病毒标准物质检测结果，1000copies/ml扩增出来的Ct值在34左右。这提示当样本中病毒载量在两者的灵敏度以上时，检测结果是比较可靠的，当病毒载量低于试剂盒检测的灵敏度时，单用任意一种试剂检测都存在错误诊断的风险。此外，这也可能和不同厂家的引物设计位点的扩增效率不同、试剂优化性能不同有关，这种扩增效率的差异在病毒核酸载量特别低时表现更明显，所以即便同一份核酸不同厂家试剂检测结果也可能有差异。本研究进一步对核酸Ct值＞36的4份标本进行测序验证后，发现RT-qPCR检测结果为A试剂阳 性/B试剂可疑、A试剂阳性/B试阳性、A试剂可疑/B试剂阴性、A试剂阴性/B试剂可疑的情况下均含有新型冠状病毒核酸，这提示病毒载量较低时任一试剂检测都可能出现假阴性
的风险。郭元元等[10]研究发现，6种试剂中有2种试剂检测能力较好，对新冠病毒弱阳性样本（ORF1ab和N基因）均能检出，而其余4种试剂只能检出其中之一。因此，对于有临床症状患者的核酸检测结果为阴性或可疑的样本均需要谨慎对待，建议有条件的实验室使用两种试剂平行检测，以提高样本检测的准确度。本研究存在的不足是测序样本数量少，本研究仅在1份双试剂检测高Ct值的双阳性标本中测序成功，但未验证到两种试剂同时检测阳性的标本中是否存在假阳性的情况，未来需要大样本研究进行探讨。
  新型冠状病毒所引起肺炎的分子机制尚未完全阐明，核酸检测作为新型冠状病毒感染确诊的金标准，其检测结果的可靠性直接影响着临床方案。目前，为了提高实验室诊断的准确性，研究人员正在开发新的灵敏度更高的新型冠状病毒检测试剂盒，同时，在检测结果的判读上也应该进行更细致的区分。新型冠状病毒抗体联合核酸检测可为临床诊断与提供更准确的依据[11,12]。同时数字PCR也已投入使用，有望提高阳性率和降低假阴性率，为更好更快确诊新型冠状病毒感染提供技术支持[13,14]。
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