从Dengvaxia的兴衰看登革热疫苗的艰辛开发历程
从Dengvaxia的兴衰看登革热疫苗的艰辛开发历程
登革热是一种通过蚊子传播的病毒性感染，类似于流感，可发展为致死性并发症，即重症登革热。登革热发病率快速上升，多发于热带和亚热带地区，全球约半数人处于登革热风险之中；在部分国家，重症登革热是儿童严重疾病和死亡的主要原因。目前没有针对性的登革热手段，及早诊断和有效医护可以将死亡率控制在1%以下。
登革热疫苗研发历经数十年，尝试了多种技术；赛诺菲巴斯德（Sanofi Pasteur）历经20多年成功研制出四价减毒活疫苗Dengvaxia，成为全球第一个上市的登革热疫苗，但上市后却引来纷争不断。本文对登革热疫苗的开发历程和现状做一总结。
一、什么是登革热
登革热，俗称"断骨热（breakbone fever）"，是由登革病毒引起的急性传染病，主要通过埃及伊蚊或白纹伊蚊叮咬传播。登革病毒属黄病毒科黄病毒属，共有4种血清型（DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4），4种血清型均可感染人，其中DENV-2型的重症率及病死率均高于其他型。各血清型病毒之间不会产生免疫作用，所以可以被不同的血清型登革病毒重
复感染。登革病毒感染后，人体可对同种血清型病毒产生持久免疫力，但对异型病毒感染不能形成有效保护，若再次感染异型或多个不同血清型病毒，发展为重症登革热的风险就会大幅上升。
登革热临床表现为高热、头痛、肌肉、骨关节剧烈酸痛、皮疹、出血倾向、淋巴结肿大、白细胞计数减少、血小板减少等。根据病情严重程度，可将登革热分为普通登革热和重症登革热（包括登革出血热和登革休克综合征）两种临床类型。
目前尚无特效的抗病毒药物，主要采取支持性及对症性措施。原则是早发现、早诊断、早、早防蚊隔离。重症病例的早期识别和及时救治是降低病死率的关键。常见的对症措施包括退热、补液和镇静止痛；针对重症登革热患者，还应考虑采取抗休克疗法、输血和保护心脏、大脑和肝肾功能等措施，以及预防并及时各种并发症。住院对症可以大幅降低死亡率，从最高的20%减少到低于1%。
登革热威胁着全球约一半人口，流行于全球热带及亚热带地区，尤其是在东南亚、太平洋岛屿和加勒比海等100多个国家和地区。WHO已经在全球登革热流行国家和地区建立起报告体系，2015年收到报告登革热病例为320万例。但是，登革热往往由于轻度非特异性至
危及生命并发症的大范围临床症状而误诊，同时监控系统的局限性也是导致登革热病例报道不足的原因。WHO在2017年公布的数字是，每年全球登革热感染为3.9亿例，其中9600万例有临床表现，另外每年约有2万人因此死亡。
二、WHO在努力
面对登革热在全球的肆虐，WHO一方面制定防控战略，另一方面也在积极指导各个国家进行登革热疫苗开发与接种工作。
制定防控战略
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中国第一块冬奥会金牌获得者是面对如此严峻的流行趋势， WHO于2012年发布《2012-2020登革热防控全球战略》，目标是在2020年相比2010年，死亡率降低50%，发病率降低25%。
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同时，WHO提出从以下5个方面着手：
∙第一，加强诊疗管理；
∙第二，全面疫情监测和应对；
∙第三，传染传播媒介持续控制；
∙第四，未来疫苗接种实施；
∙第五，执行和操作层面基础研究。
资助启动疫苗研究
1976年1月，WHO东南亚区域医学研究咨询委员会（SEA/ACMR）第一次会议在印度新德里召开。在那次会议上，与会人员达成共识向WHO东南亚区域主任建议将重症登革热研究纳入优先事项。
1976年8月，SEA/ACMR第二次会议回顾了东南亚地区登革热疫情的传播情况，同时评估了对登革热流行病学、病毒学、发病机理和临床管理的最新认识。
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1977年2月，SEA/ACMR重症登革热研究小组会议上提出两项工作重点：一是疫苗研究，二是控制埃及伊蚊。疫苗研究的第一个计划就是东南亚和西太平洋地区病毒学家前往夏威夷大学热带医学和临床微生物学学院接受疫苗研发相关培训。培训完成后，回到各自国家参与登革热疫苗开发项目。
1978年，WHO指定泰国Mahidol大学附属Ramathibodi医院下属的医学院病理系承担疫苗研发任务。
1980年，WHO开始拨付资金。Mahidol大学设立三个实验室并添置设备和制定操作规程，又招募了病毒学家前往夏威夷大学开始疫苗前期研发。
汽车电瓶如何充电1987年，研究团队整体转移到Mahidol大学疫苗开发中心。
1990年，实验动物房和疫苗中试车间投入运营。
1993年1月，Mahidol大学与赛诺菲巴斯德（Sanofi Pasteur）签署协议合作开发登革热四价减毒活疫苗，由后者进行工业化开发。双方共同开展临床试验。
2004年，由于DENV-3病毒株存在反应原性且无法解决，赛诺菲巴斯德决定放弃。
从1980年到1995年的十五年间，WHO累积资助250万美元，并且从1983年到1994年每年召开专门会议商讨疫苗开发进展。
虽然经历了失败，但WHO在病毒株筛选、药学开发和临床试验方面积累了大量经验，为今
后指导疫苗开发，制定相关指导原则奠定重要基础。此外，赛诺菲巴斯德在这个过程中对四种血清型登革病毒有了深刻的了解，而且与Mahidol大学合作过程也为后来在泰国开展临床试验积累了丰富的经验。而且，在此期间挑选出来的病毒株DENV-2（16681）PDK 53后来被用作骨架做进一步研究，成为Takeda项目的重要基础。
指导疫苗开发
为了指导各个国家药品监管机构和各个药厂在疫苗审评审批环节的工作，WHO早在2006年和2011年发布和更新了关于第一代登革热四价疫苗研发的指导原则，涵盖了第一代登革热减毒活疫苗生产、质量控制、临床前开发和临床评价内容，并提出该指导原则会随着第二代疫苗新技术的出现而不断更新。指导原则指出，登革热疫苗的安全性和有效性的评价工作应当特别细致，尤其是试验受试者在接种疫苗后长期随访、疫苗上市后研究以及监控疫苗对登革热流行病学和疾病负担影响的监测体系。
在《2012-2020登革热防控全球战略》中，WHO预计在2014年到2016年之间会有登革热疫苗批准上市。
指导疫苗接种
WHO除了指导工业界和各国药品监管机构开发和审评审批相关疫苗产品，还为各国卫生防疫机构指导制定相关接种政策和实施方案。
WHO指出，登革热流行国家和地区在期待科研人员努力开发疫苗产品之时，应当确保建立起强有力的药品监管和监测体制，同时立刻着手准备疫苗接种规划，包括疫苗产品信息，以及疫苗接种策略、疫苗对疾病负担的影响和性价比，还有疫苗接种实施过程中的诸多问题，如纳入全民免疫计划、疫苗储存运输、财政保障等。
三、疫苗开发之路
夏家三千金分集介绍由于登革病毒有四种血清型，感染其中一种血清型之后并不会对其他三种血清型产生免疫，且一旦再次感染，疾病严重性会显著上升，因此业内达成共识开发四价登革热疫苗。
下面按不同技术介绍几种进入临床阶段的项目。
1. 传统减毒活疫苗
传统减毒活疫苗通过细胞培养多次传代获得。人们已经利用这种技术成功开发出天花疫苗
和Sabin疫苗。针对登革病毒，夏威夷大学开发出通过原代狗肾细胞（PDK）进行多次传代的方法。每次病毒传代，在外源宿主细胞（PDK）中培养的病毒基因组中就有可能产生减毒点突变。在传代过程中，主要关注以下减毒标记筛选和评价病毒生物学性质：
∙在一定温度条件下复制
∙噬斑较小
∙细胞病变效应
∙小鼠神经毒性
∙人单核细胞生长
一般来说，需要经历10-50次传代才能获得候选疫苗。
这种方式的优势在于持续的体液免疫反应和细胞免疫反应，从而对病毒结构蛋白和非结构蛋白都有广泛的抗原反应。不过在理论上也存在一定风险，即有可能转化为具有毒性的野生表型，特别是在四价病毒组合物中。此外这种四价疫苗中的不同血清型之间存在病毒或
免疫干扰。
泰国Mahidol大学II期失败
Mahidol大学的四种血清型病毒株全部从东南亚重症登革热感染患者体内分离得到，在哺乳动物细胞上传代，然后通过胸内途径接种到安布因巨蚊（Toxorhynchites amboinensis）或埃及伊蚊上，消除非虫媒病毒，因为只有虫媒病毒可以在胸内给药后迁移到蚊子的唾液腺中。再将蚊子头部取下并磨碎，从而获得纯净病毒株。
接下来，每隔5-10天，在32℃时，血清型1,2,4病毒在原代狗肾细胞（PDK）上传代，而血清型3病毒通过绿猴肾细胞（GMK）上传代，最后在胎猕猴肺细胞（FRhL）上培养减毒，从而获得适用于疫苗的病毒株，即：

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