谈谈如何分析RealtimePCR的结果
谈谈如何分析RealtimePCR的结果
一直瞎白话，作为一名知识分子，好歹也得干点儿正经事，既然做科研，就得严谨，就得实事求是。言归正传，写点儿如何分析Realtime PCR结果的体会。为什么想这个呢？我们实验室现在做这个的越来越多，但是看到他们做Presentation时的结果分析的统计图就知道，他们没踏实搞清楚如何去分析结果，就上去糊弄老板了，我曾严肃的当场指出过，但是师气得直瞪眼，丫就不明白我是真为她好，我也就懒得跟她纠缠了。但是作为当代，我国，世界级著名学府（校领导自称的），一流专业（就是没什么人报名，一半是调剂的），牛B教授（这个是实话）的不用心学生，我还是忍不住要说一说。
关于Realtime PCR的所有情况的结果如何分析，我不都懂，也不想都懂，但是我需要的关于基因表达差异的2-ΔΔCt分析方法，这一点我还是比较清楚的。
原理：
其实就是这个公式：Xn=Xo × (1+Ex)n
Xn，表示n个循环后的分子数;
Xo，表示初始模板分子数;
Ex，表示分子扩增效率;
n，表示循环数。
首先我们要明白，Realtime PCR的终极目的是要检测其初始模板的量的相对或绝对量（这就是半定量或定量Realtime PCR的区别）。还有一个最为重要的概念就是Ct值，是指目标扩增产物达到所设定的阈值时所经历循环数。
再回到刚才的公式中，我们可以得到下面的式子：
Xt = Xo × (1+Ex)Ctx = Kx （1）
Xt，表示到达阈值时的分子数;
Kx，是个常数，因为这是人为设定的。
其他同前式。那么，同理，内参也有一个这样的式子：
Rt = Ro × (1+Ex)CtR = KR （2）
把结果均一化，所谓均一化就是通过内参的比较，去除加入模板时的人为差异，即（1）除以（2）得出，
Xt / Rt = Xo / Ro × (1+Ex)CtX - CtR  = Kx / KR
进一步推出我们关注的初始模板均一化值：
Xo / Ro = Kx / KR × (1+Ex)-（CtX - CtR），
令CtX - CtR =ΔCt，因此，可得
Xo / Ro = Kx / KR × (1+Ex)ΔCt （3）
至此，我们得到了组内的模板的均一化相对或绝对值，下一步是组间的差异比较。
所谓组间差异比较，在实验中往往就是实验组与正常组，或者是两种或多种处理方法之间的差异比较，因此我们就要将正常组或者其中一个处理组称为参照（Calibrator，cb），同
样的这个参照组也会得到一个上述（3）的式子：
Xcbo / Rcbo = Kcbx / KcbR × (1+Ecbx)ΔCtcb （4）
再次均一化处理，目的是得到两组之间的差异，当然若是实验中有多组，亦可以多组依次与cb组比较，所得结果可直接观察到组间差异。
也就是：（3）除以（4），得
X / Xcb = (1+E)-(ΔCt-ΔCtcb)
再令  -(ΔCt -ΔCtcb) = -ΔΔCt（5）
对于一个小于150bp的扩增片段，扩增效率E近似等于1，所以，最终我们得到的均一化后的初始模板量 = 2ΔΔCt
至此，我们了解了-ΔΔCt是怎么来的。下面是具体拿到结果如何分析。
应用
我们做完Realtime PCR后得到的结果往往是一个EXCEL文档，里面是每组的Ct北京 小吃值。拿到Ct值后，我们按照下面步骤来：
（1）按实验组，Calibrator组，组内参把Ct值分类。
（2）套公式，2-ΔΔCt = 2-(ΔCt -ΔCtcb) 就可计算出每个实验组对
Calibrator组的相对值。
（3）做统计图，将Calibrator组设为1，分别绘制其余各组的图。退税多久能到账
以自己的实验为例，进行说明：
（1）首先，拿到数据后，分类，套公式计算：
Ct值   ΔCt  2ΔΔCt          复孔 1              复孔 2
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HBs
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  -8.76
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 0.3978
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29.96
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HBs
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 0.0102
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（2）然后，整理如下：
HBs
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0.2932
0.4033
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0.3978
X
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0.0023
0.0242
0.0390
0.0470
0.0097
E
    0.0115
0.0011
0.0257
0.0372
0.0235
0.0050
（4）最后，求平均值做统计图。
最后声明，以上内容是本人辛苦学习，查阅资料后总结出的心得，一方面为自己留个笔记，一方面让懒得去总结的朋友省点儿事儿，如果您看明白了，我想可以一起交流，要是您没看懂，或者压根儿就懒得看，那您也别随便瞎说。但是无论您是哪一种，请别不负责任的随便转帖，当然真牛B的人也不屑转我这破烂儿。

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