一种装载shRNA的外泌体及其构建方法与应用[发明专利]
(19)中华人民共和国国家知识产权局
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(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010228864.4
(22)申请日 2020.03.27
(71)申请人 暨南大学
地址 510632 广东省广州市天河区黄埔大
道西601号
(72)发明人 谢秋玲　麦俊新　季煜华　熊盛　
(74)专利代理机构 广州市华学知识产权代理有
限公司 44245
代理人 苏运贞
(51)Int.Cl.
C12N  5/10(2006.01)
C12N  15/85(2006.01)
C12N  15/113(2010.01)
A61K  48/00(2006.01)
(54)发明名称一种装载shRNA的外泌体及其构建方法与应用(57)摘要本发明公开了一种装载shRNA的外泌体及其构建方法与应用。本发明通过将可以有效沉默靶基因的shRNA序列克隆入表达载体，得到重组表达载体1；shRNA序列包括依次连接的靶序列、茎环结构序列和靶序列的互补序列；然后将能
与所述的茎环结构特异性结合的蛋白A的基因与外泌体膜蛋白的基因连接，得到融合基因序列，再将所得的融合基因序列克隆入表达载体，得到重组表达载体2；最后将重组表达载体1、2同时转染细胞，培养转染后细胞，收集外泌体，即获得所述的装载shRNA的外泌体。该方法操作简单易行，工艺稳定，适用性好。所得外泌体中包载有大量shRNA，
可以作为一种高效的药物传递系统。
权利要求书2页  说明书8页序列表16页  附图5页CN 111424017 A 2020.07.17
C N  111424017
A
1.一种装载shRNA的外泌体的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)设计、合成可以有效沉默靶基因的shRNA序列；将所述的shRNA序列克隆入表达载体，得到重组表达载体1；所述的shRNA序列包括依次连接的靶序列、茎环结构序列和靶序列的互补序列；
(2)将能与所述的茎环结构特异性结合的蛋白的基因与外泌体膜蛋白的基因连接，得到融合基因序列，再将所得的融合基因序列克隆入表达载体，得到重组表达载体2；
(3)将步骤(1)得到的重组表达载体1和步骤(2)得到的重组表达载体2同时转染细胞，培养转染后细胞，收集外泌体，即获得所述的装载shRNA的外泌体。
2.根据权利要求1所述的装载shRNA的外泌体的构建方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的茎环结构序列为GCTGACCCGAAAGGGCGTGATGC。
征服 孙红雷3.根据权利要求1所述的装载shRNA的外泌体的构建方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的能与所述的茎环结构特异性结合的蛋白选自RNA结合蛋白L7Ae、NHP2核糖核蛋白样蛋白1、人核蛋白P56和人核蛋白P58中的至少一种；
步骤(2)中所述的外泌体膜蛋白为CD63、CD81、CD9和TP01中的至少一种。凡是都造句
4.根据权利要求3所述的装载shRNA的外泌体的构建方法，其特征在于：
所述的RNA结合蛋白L7Ae的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述的NHP2核糖核蛋白样蛋白1的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述的人核蛋白P56的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；
所述的人核蛋白P58的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；
所述的CD63的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示；
所述的CD81的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示；
所述的CD9的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示；
所述的TP01的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。
5.根据权利要求3所述的装载shRNA的外泌体的构建方法，其特征在于：
所述的RNA结合蛋白L7Ae的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
所述的NHP2核糖核蛋白样蛋白1的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
所述的人核蛋白P56的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；
所述的人核蛋白P58的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；
所述的CD63的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；
西班牙签证查询所述的CD81的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；
所述的CD9的核苷酸序列如SEQ ID NO 16所示；
所述的TP01的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。
6.根据权利要求1所述的装载shRNA的外泌体的构建方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的连接为通过接头连接，连接的顺序为蛋白A的基因片段-接头-外泌体膜蛋白基因片段；
所述的接头的核苷酸序列为：
GGTGGAGGTGGCAGCGGAGGAGGTGGGTCCGGCGGTGGAGGAAGC。
7.根据权利要求1所述的装载shRNA的外泌体的构建方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的表达载体为pRNAT-U6.1/Neo；
步骤(2)中所述的表达载体为pCDNA3.4。
8.根据权利要求1所述的装载shRNA的外泌体的构建方法，其特征在于：
步骤(3)中，在转染细胞时，重组表达载体1和重组表达载体2的数量比为1～2:1～2。
9.一种装载shRNA的外泌体，其特征在于：根据权利要求1～8任一项所述的构建方法得到。
10.权利要求9所述的外泌体在作为基因的靶向递送系统中的应用。
一种装载shRNA的外泌体及其构建方法与应用
技术领域
[0001]本发明属于生物技术领域，特别涉及一种装载shRNA的外泌体及其构建方法与应用。
背景技术
[0002]RNA干扰(RNAi)是有效沉默或抑制目标基因表达的过程，该过程通过双链RNA (dsRNA)使得目标基因相应的mRNA选择性失活来实现的。沉默机制可导致由小干扰RNA (siRNA)或短发夹RNA(shRNA)诱导实现靶mRNA的降解，或者通过小RNA(miRNA)诱导特定mRNA翻译的抑制。siRNA和shRNA都已用来基因。其中短发夹RNA(shRNA)，包含一个环结构，可加工成siRNA发挥作用，也可通过与目标mRNA互补结合序列特异性地实现靶mRNA降解。shRNA比siRNA的优势包括能够使用病毒载体进行转染，克服了某些类型的细胞不能转染的难题，能选择使用诱导型启动子控制shRNA表达，能够与报告基因共表达。此外，它们能减少脱靶效应。
[0003]外泌体(exosomes)是由细胞分泌的直径为30～150nm的囊泡，细胞质膜凹陷形成的细胞内小泡，具有与细胞膜相同的膜结构，可以携带诸如RNA、蛋白质等大量成分，与细胞的生物学功能及细胞间的信号传递有着密切的关系。因其特殊的结构，相较人工合成的药物载体，外泌体作为药物载体进行药物运输有独特的优势，主要体现在外泌体的膜结构与细胞膜相同，可以提高药物进入细胞的效率，甚至可以透过血脑屏障，同时外泌体引起的有害免疫反应极低，有很好的渗透滞留(EPR)效应从而具有缓释效果等。目前已经尝试用外泌体携带siRNA、化学小分子药物等进行基因和肿瘤等研究。外泌体包载siRNA等小分子多采用将外泌体与小分子孵育的方式，包载率一般较低。
[0004]因此，如何实现外泌体对shRNA更高效的包载，是当前亟待解决研究的关键问题。
发明内容
[0005]本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种装载shRNA的外泌体的构建方法。
[0006]本发明的另一目的在于提供一种装载shRNA的外泌体。
[0007]本发明的另一目的在于提供上述装载shRNA的外泌体的应用。
[0008]本发明的目的通过下述技术方案实现：
就业最好的专业
[0009]一种装载shRNA的外泌体的构建方法，包括如下步骤：
[0010](1)设计、合成可以有效沉默靶基因的shRNA序列；将所述的shRNA序列克隆入表达载体，得到重组表达载体1；所述的shRNA序列包括依次连接的靶序列、茎环结构(Kt-loop)序列和靶序列的互补序列；
[0011](2)将能与所述的茎环结构特异性结合的蛋白的基因与外泌体膜蛋白的基因连接，得到融合基因序列，再将所得的融合基因序列克隆入表达载体，得到重组表达载体2；[0012](3)将步骤(1)得到的重组表达载体1和步骤(2)得到的重组表达载体2同时转染细
胞，培养转染后细胞，收集外泌体，即获得所述的装载shRNA的外泌体。
[0013]设计步骤(1)中所述的shRNA序列时，需通过构建包含所述的shRNA序列的重组表达载体，转染细胞，验证其具有沉默靶基因的功能。
[0014]步骤(1)中所述的茎环结构序列为GCTGACCCGAAAGGGCGTGATGC。
[0015]步骤(1)中所述的表达载体优选为pRNAT-U6.1/Neo。
[0016]步骤(2)中所述的能与茎环结构特异性结合的蛋白可选自RNA结合蛋白L7Ae、NHP2核糖核蛋白
样蛋白1(NH2L1_HUMAN NHP2-like protein 1)、人核蛋白P56(HumanNOP56_ HUMAN Nucleolar protein 56)和人核蛋白P58(HumanNOP58_HUMAN Nucleolar protein 58)中的至少一种；优选为RNA结合蛋白L7Ae。
[0017]所述的RNA结合蛋白L7Ae的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0018]所述的RNA结合蛋白L7Ae的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0019]所述的NHP2核糖核蛋白样蛋白1的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0020]所述的NHP2核糖核蛋白样蛋白1的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
[0021]所述的人核蛋白P56的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
[0022]所述的人核蛋白P56的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
[0023]所述的人核蛋白P58的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。
[0024]所述的人核蛋白P58的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
[0025]步骤(2)中所述的外泌体膜蛋白优选为CD63、CD81、CD9和TP01中的至少一种；更优选为CD6
3。
[0026]所述的CD63的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。
[0027]所述的CD63的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
[0028]所述的CD81的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示。
[0029]所述的CD81的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。
[0030]所述的CD9的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。
[0031]所述的CD9的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。
[0032]所述的TP01的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。
[0033]所述的TP01的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。
[0034]步骤(2)中所述的连接优选为通过接头连接，连接的顺序为蛋白A的基因片段-接头-外泌体膜蛋白基因片段。
[0035]所述的接头的核苷酸序列为：
[0036]GGTGGAGGTGGCAGCGGAGGAGGTGGGTCCGGCGGTGGAGGAAGC。
[0037]步骤(2)中所述的表达载体优选为pCDNA3.4。
iphone如何设置铃声[0038]步骤(3)中，在转染细胞时，重组表达载体1和重组表达载体2的数量比优选为1～2:1～2；更优选为1:1。
[0039]步骤(3)中，收集外泌体的方法参照中国专利申请CN201811023079.4实施例2步骤3中“外泌体的提取”的方法、步骤进行。
[0040]所述的装载shRNA的外泌体的构建方法可适用于多种靶基因。所述的靶基因可以根据需要进行选择，例如EGFP、bFGF，EGFR等。
[0041]当所述的靶基因为EGFP时，所述的靶序列为GGCATCAAGGTGAACTTCA。

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