侧流免疫层析实验实验报告
侧流免疫层析实验实验报告
侧流免疫层析是一种基于抗原、抗体免疫反应的经典床旁检测技术。最初，研究人员采用纳米金制备层析试纸条，用于尿人绒毛膜促性腺激素检测，即我们熟知的胶体金。但检测结果依赖人工判读，且检测灵敏度低、假阴性率高。随后，一些对层析膜进行简单图像采集、处理的仪器相继出现，LFIA结果判读实现自动、半定量化。
近年来，LFIA不断发展，检测性能得到很大提升，已逐步向定量检测过渡，其可检测样品多样（如全血、血浆、汗液、唾液，尿液等），并且能对核酸进行检测。本文综述了LFIA检测系统的研究进展以及LFIA的商品化应用现状，以期为相关领域提供参考。
一、LFIA结构及定量检测
侧流免疫层析试纸条由样品垫、结合垫、层析膜、吸水纸和聚氯乙烯底板五部分组成。单克隆抗体和二抗被预先固定在层析膜上以形成测试线或对照线，加入含待测物的样品后，待测物与结合垫上的标记抗体结合，随层析作用进一步被固定在T线上的单抗捕获。过量的标记抗体被C线上的二抗捕获，通过特定检测仪器读取T/C线上的标记物信号强度，并代入预先绘制的标准曲线，在保留LFIA优点的同时实现了LFIA对待测物的定量分析。
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对于完整的LFIA定量检测系统而言，标记物、层析膜、检测仪是保障定量结果快速、灵敏、准确的基础。在近十年里，已研发出不同信号类型的灵敏标记物以及多种新型层析膜材料，还设计了一系列价格合理、结构紧凑的检测设备用于免疫层析结果的记录和量化。特别地，为保证定量结果溯源性，对试验中所使用的标记物、耗材、试剂、仪器及检测程序均可开展量值溯源工作，以使LFIA产品的检测结果溯源至国家或国际标准。可用经典的蛋白和分子检测方法，作为验证LFIA诊断效能的参比方法，如酶联免疫吸附试验和聚合酶链反应等。
LFIA实现定量检测使得检测结果不受主观因素制约，大大提高了其在即时检测领域的应用深度与广度。下文就实现LFIA定量检测的三个重要组成部件即标记物、检测仪器、层析膜以及取得的应用进展进行详细阐述。
二、LFIA检测系统进展
（一）高灵敏标记物
纳米标记物的成功应用使LFIA迈向定量检测的新台阶，根据标记物产生的信号不同，将其
大致分为三类：（1）有型标记物：会产生肉眼可见的颜；（2）荧光型标记物：在特定光源激发下可产生荧光；（3）其他标记物：包括纳米酶、磁珠等，分别产生酶学信号、磁信号。
1.有型标记物：
纳米金在水溶液中由于表面静电作用呈胶体状态，具有优异的理化性质且易于功能化，是LFIA中最常用的标记物。但AuNPs存在粒径分布宽、稳定性差、储存条件高的不足。近年来，已有研究采用油相合成、化学键合等方法来对AuNPs进行增强、组装、聚合，如二维黑磷，改良后的AuNPs既保留了原有特性，稳定性又得到很大提升，在微量药物、病毒糖蛋白的定量检测中，显示出广阔的应用前景。
碳纳米管是由石墨烯片组成的无缝空心管状体，具有高比表面积、良好的机械强度和化学惰性。另外，自身黑使AuNPs具有很强的辨识度，因此CNTs的灵敏度比AuNPs更高。但CNTs易于聚集，几乎不溶于任何有机溶剂。在CNTs表面添加亲水性的共价官能团，可改善CNTs的溶解性局限，并获得更好的稳定性，尤其适用于小分子化合物和特定蛋白的定量检测[5]。
2.荧光标记物：
由于有型标记物信号放大能力有限，现已将许多新型荧光材料用于LFIA的定量检测，常用的荧光标记物有量子点、镧系元素等。
量子点是一种半导体荧光纳米晶体，荧光强度大且稳定，其发光光谱可调、狭窄、对称，适用于微量物质的检测。单一的QD经过两亲聚合物修饰后，可制备成核壳型量子点，其稳定性更好、保存期更长。在肿瘤标志物和小分子药物的检测中，检测限可低至5.8ng/ml。以QD为标记物的LFIA，还适用于荧光猝灭的方法，较其他标记物具有更宽的线性范围，在感染性疾病诊断、肿瘤诊断试剂开发和药物监测领域前景可观。
镧系元素具有原子态发射、长荧光寿命、窄发射光谱、宽斯托克斯位移的特性，常用作基于时间分辨的免疫分析，在小分子药物检测中，表现出良好的重复性，LOD比最灵敏的AuNPs低约100倍。但LE在水溶液中存在低荧光产量的缺陷，可将LE与纳米微球等载体结合，以增加荧光产量。上转发光粒子是由稀土金属元素合成的晶体材料，和其他标记物相比，UCP具有独特的上转发光现象、低背景干扰和高稳定性，非常适合于检测成分复杂的样品，如尿液、唾液等。检测结果与培养法和PCR法高度一致，可在20min内检测10种食
源性致病菌。
荧光微球通常由纳米微球包裹荧光材料或在其表面偶联荧光物质制备而成，具有良好的亲和性和高比表面积，目前已经制备出包含有机染料、QD、UCP等荧光材料的FMS。但FMS合成步骤复杂、产率低、成本高，仅在生物酶、小分子药物的检测中有研究报道。
3.其他标记物：
拉曼散射指荧光物质的吸收光与发射光不等的现象，不同物质的拉曼散射不同，将拉曼分子与金属表面接触后可实现拉曼信号的放大，即表面增强拉曼散射，SERS信号稳定、灵敏，可用于多重检测生物大分子蛋白、病毒、细菌，但对特殊检测仪器的依赖，使得SERS在实际应用中并不广泛。超顺磁珠是具有磁性内核和活性基团表面的复合纳米材料，具有易分离、信号稳定等优点，其结果不受样品中有成分的影响，在微量激素、肿瘤标志物、药物检测中具有良好的应用前景，但超顺磁珠需要磁检测器或巨磁阻传感器，在一定程度上限制了其应用。纳米酶是一类具有多孔结构的双金属纳米粒子，具有高比表面积和特殊的酶催化性能，但纳米酶合成困难、需额外的显步骤。与胶体金相比，纳米酶灵敏度提高了两个数量级，其LOD和线性范围与商业ELISA试剂盒相当。
（二）检测仪器
1.金标检测仪：
针对不同标记物信号，需用不同的检测仪器。早期的免疫层析检测仪主要针对AuNPs设计，大多将T/C线的颜信号转换成电信号或灰度图像，如光敏电阻法、图像处理法等，由于T/C线的宽度较窄，光敏电阻法的信号响应受到限制；图像处理法也存在对灰度图像的利用不充分的缺点。现已报道了多种新型金标检测仪，如光热成像分析仪、压力读数仪[4，12]，通过分析仪检测T/C线温度、气压变化，经过简单的数字转换就可以得到定量检测结果，灵敏度比光敏电阻法高68倍，有望应用于生物大分子检测。
2.荧光检测仪：
随着荧光标记物的广泛使用，其配套的荧光检测仪也在不断的更新发展，为LFIA的检测提供了一种简单、快速、准确和定量的工具，不仅具有量化和客观解释结果的优势，还可以自动存档和传输结果。现有的荧光检测仪主要有直接检测荧光强度和智能手机两种模式。

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