新型冠状病毒体外诊断技术研发现状与展望
D O I  ： 10. 13523/j . c b . 2009039
|行业分析|
新型冠状病毒体外诊断技术研发现状与展望*
范月蕾王跃王恒哲李丹丹毛开云#
(中国科学院上海生命科学信息中心中国科学院上海营养与健康研究所上海200031)
摘要随着新型冠状病毒（SARS -C 〇V -2)引发的全球疫情不断加剧，新型冠状病毒体外诊断技术 与产品的研发成为全球生物医药领域关注的重点，体外诊断技术与产品的研发创新对于提升新 发突发传染病的防控能力有着重要的意义。对2019年12月至2020年12月期间国内外新型冠 状病毒体外诊断技术与产品的研发现状与发展趋势进行了综述，即包括聚合酶链反应技术、核酸 等温扩增技术、免疫层析技术、化学发光免疫分析技术等传统分子诊断技术与免疫诊断技术，也 包括CRISPR 技术、生物传感器技术、纳米技术等新兴技术在新型冠状病毒检测中的应用，以期为 新发突发传染病体外诊断技术的研发与政府的科技决策提供参考。关键词新型冠状病毒体外诊断疫情防控 中图分类号Q 819
2〇丨9年底爆发的新型冠状病毒（SARS -C 〇V -2)(以 下简称新冠病毒）引起的肺炎疫情，对我国乃至全球的 公共卫生体系、人民生命健康安全和国家经济发展形 成了巨大威胁。截至2020年12月7日，
新型冠状病毒 肺炎（COVm -19)已在200多个国家或地区蔓延，全球 累计新冠确诊病例达6624. 4万人，累计死亡病例达 152.9万人，海外新冠疫情的蔓延程度远远超过国 内，全球疫情防控形势仍然严峻。对于COV 1D -19的疫 情防控，准确、快速地识别无症状感染者是遏制病毒向 密切接触者传播的关键，一项对“钻石公主号”邮轮新 冠患者的研究结果表明，在COVID -19爆发的早期阶 段，无症状感染者在所有感染者中的比例为17. 9% [2]。因此，针对病毒的早期诊断从而对高风险患者进行有 效的隔离与干预至关重要，而基于体外诊断技术的疾 病检测成为与疫情赛跑的关键。根据我国新冠病毒肺 炎诊疗方案（试行第八版），在新冠病毒感染检查中，体 外诊断技术主要应用于一般检查与病原学及血清学检
收稿日期:2020~09-27 修回日期:2020-丨2*09
*上海市2020年度“科技创新行动汁划”软科学重点项目 (20692109200)资助项目 **通讯作者，：*************
中国生物工程杂志 China  Biotechn 〇l 〇gy ，2021，41 (2/3) :150-161
查，一般检查主要针对血细胞技术、c 反应蛋白、肝酶、 乳酸脱氢酶、肌酶等常规病毒感染指标开展，主要用于 评估疾病的发展程度，不能对COVID -19进行有效识 别；而病原学及血清学检查通过核酸诊断（RT -PCR 和/ 或NGS 方法）和免疫诊断（检查新冠病毒特异性Ig M  抗体、IgG 抗体）对疑
似病例进行早期诊断，可对是否感 染新冠病毒进行有效识别，是本文讨论的重点。
目前，商业使用的COV 1D -19诊断方法主要分为两 类，一类为基于聚合酶链反应（PCR )、核酸杂交和二代 测序技术为主的分子诊断技术；另一类是检测患者暴 露于新冠病毒后体内产生的抗原或抗体的免疫诊断技 术。分子诊断技术是新冠病毒检测的“金标准”，具有 早期诊断、灵敏度和特异性高等特点，可用于处于新冠 病毒感染窗口期的患者，是病毒存在的“直接证据”；免 疫诊断技术作为核酸诊断的补充手段，可用于感染早 期的患者诊断，或对康复患者的免疫状态进行追踪和 检测，是病毒存在的“间接证据”。随着新技术的应用 与产品研发的不断深人，新冠病毒体外诊断竞争的焦 点逐步向特异性更强、灵敏度更高、检测速度更快、价 格更低廉及检测自动化方向发展，CRISPR 技术、集成 流体芯片、生物传感器、纳米技术、可穿戴设备和移动
2021,41(2/3)范月蕾等：新型冠状病毒体外诊断技术研发现状与展望151
应用程序等也被用于新冠病毒体外诊断产品的研发中。本文在兼顾传统体外诊断方法与新技术应用的基 础上，综述了全球新冠病毒体外诊断技术与产品领域的研发现状与发展趋势，分析本次疫情体外诊断技术 的研发策略与技术特点，为企业与研究机构当前与未来新发突发传染病体外诊断技术与产品的研发布局与 政府的科技决策提供参考。
1新冠病毒分子诊断技术研发现状
S A R S-C o V-2是一种正义的单链R N A病毒，其基因 组有近3万个碱基，及时获取S A R S-C o V-2的基因组序 列对于新冠病毒分子诊断工具的研发至关重要。2020 年2月，/Vamre Biotec/moZogy上的一篇报道详细梳理了 国际学术界在研发新冠病毒诊断方法中的成果，并指 出相比2002〜2003年S A R S冠状病毒用近6个月才建 立有效的鉴定方法，新冠病毒诊断领域的研究进展迅速。早在2020年丨月10月，研究人员使用宏基因组(metagenomic)R N A测序，从在武汉海鲜市场工作的患 者中发现了未知的冠状病毒。并首次将初步的基因组 序列存放于G e n B a n k数据库中〜，序列的公布极大地 加快了新冠病毒特异性引物和探针的设计工作。2020 年1月26日，上海捷诺生物科技有限公司、上海之江生 物科技股份有限公司和华大生物科技（武汉）有限公司 基于荧光P C R技术的新冠病毒核酸检测试剂盒分别通 过药品监督管理局（N M P A)应急审批程序批准上市，成 为全球最早获得政府机构批准使用的新冠病毒诊断产 品〇除了逆转录-聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction,R T-P C R)技术外，核酸等温扩 增技术、微阵列技术、高通量测序技术等均在新型冠状 病毒分子诊断产品研发中得到了广泛应用。
1.1逆转录-聚合酶链反应技术
作为新冠病毒鉴定的“金标准”以及最早被用于新 冠病毒识别的体外诊断技术，R T-P C R技术非常灵敏，可定量检测出低拷贝数的病毒R N A，在已上市的分子 体外诊断产品中，基于R T-P C R的新冠病毒检测试剂占 比超过70%[参考N M P A与美国食品药品监督管理局 (F D A)批准上市的新冠病毒核酸诊
断产品]。新冠病 毒R T-P C R的检测对象通常为鼻咽拭子等呼吸道采集 标本，虽然血液、粪便、尿液也被用于部分检测中，但这 些标本的假阴性率较高[4~。为了应对全球用于新冠检测医用拭子的供应缺口以及标本获取的不便，Rutgers Clinical Genom i cs Laboratory 的 R T-P C R 新冠检测技术（TaqPath S A R S-C o V-2-A s s a y)实现了通过提取唾液进行检测，在家中即可采集标本并进行检测[6]，该 产品已由T h e r m o Fisher Scientific公司研发并生产，并 进人了世界卫生组织（W H O)的紧急使用清单（E U L)以及F D A的紧急使用授权（E U A)。传统的R T-P C R包 括一步法与两步法，一步法R T-P C R能克隆微量m R N A 而不需要构建c D N A文库，两步法需首先用逆转录酶合 成c D N A，然后以c D N A为模板进行P C R反应。相比之 下，一步法快速、简便、敏感度较高且污染机会少，是新 冠病毒检测的首选方法[7]。病毒中特异性R N A序列 是区分该病毒与其他病原体的标志物，目前批准产品 均基于新冠病毒基因组中开放读码框（open reading fr a m e)0R F l a b或0R F8区域，核蛋白（N)、病毒包膜(E)、基质蛋白（M)和刺突蛋白（S)4种结构蛋白及依 赖于R N A的R N A聚合酶（R d R p)进行选择。截至 2020年12月7日，我国已上市的24件新冠病毒核酸检测试剂中，基于R T-P C R技术的产品为18件；美国已 上市的196件新冠病毒核酸检测试剂中，基于R T-P C R 技术的产品为157件（表1)。
随着检测方法的改进和自动化程度的提升，新冠 病毒的R T-P C R检测也在不断发展。虽然R T-P C R是 新冠病毒检测领域最广泛的使用方法，但仍存在着耗时长、场地与人员要求高、检测设备昂贵等缺
陷，提升 检测效率是R T-P C R技术优化的关键。针对R T-P C R 检测耗时长等问题，G e n M a r k Diagnostics公司的产品ePIex S A R S-C o V-2 test 采用其ePlex 设备将病毒R N A 提取、c D N A扩增与检测结果生成高度整合[8]。Cepheid公司的 Xperlfi Xpress S A R S-C o V-2 检测产品可 提供新冠病毒的即时检测，采用C e p h e i d的Xpertfi-X p r e s s墨盒技术，仅需45m i n即可提供结果，该产品已 获得美国F D A的紧急使用授权[9]。
1.2核酸等温扩增技术
R T-P C R必须采用精密的热循环设备经过变性、退 火、延伸三个步骤，而核酸等温扩增技术的反应过程始 终维持在恒定的温度下，通过添加不同活性的酶和特异性引物来达到快速核酸扩增的目的，与常规R T-P C R 相比，具有灵敏度高、快速与便携式等特点[1°]。
6g研发中国开跑1.2.1逆转录环介导等温扩增技术逆转录环介导等温扩增（reverse transcription loop-me-diated isothermal amplification，R T-L A M P)技术已发展成为一种快速、经 济、有效的新冠病毒检测分子诊断方法，R T-L A M P将环 介导等温扩增（L A M P)以及逆转录相结合，直接检测出
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表1基于R T-P C R的已上市新冠病毒检测产品例举
T a b le 1E x a m p le s o f S A R S-C o V-2 d etectio n p ro d u c ts b a s e d o n R T-P C R
产品名称生产企业检测基因区域批准国家批准时间
新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测
试剂盒（荧光PCR法）
上海捷诺生物科技有限公司基因、iV基因中国2020.1.26
新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测
试剂盒（荧光PCR法）
华大生物科技（武汉）有限公司基因中国2020. 1.26
新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测
试剂盒（荧光PCR法）
上海伯杰医疗科技有限公司基因、/V基因中国2020.1.26
新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测
试剂盒（荧光PCR法）
中山大学达安基因股份有限公M基因、N基因中国2020.1.28
新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测
试剂盒（荧光PCR法）
北京纳捷诊断试剂有限公司基因、/V基因中国2020.6.9
新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测
试剂盒（荧光PCR法）
中山大学达安基因股份有限公司基因、/V基因中国2020.9.21
新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测
试剂盒（荧光PCR法）
上海捷诺生物科技有限公司基因、/V基因中国2020.11.20 COVID-19 RT-PCR test I^iil)C o rj) Laboratory Corporation of Am erica/V基因美国2020.3. 16
C0C 2019- Novel Coronavirus Real-
Time RT-PCR Diagnostic Panel
CDC W基因美国2020.2.4 BioFire COVID-19 test BioFire Defense, LLC O R F la b,ORF8美国2020.3.23 Xpert Xpress SARS-CoV-2 test Cepheid/V基因、£基因美国2020.3.20 MassARRAY SARS-CoV-2 Panel Agena Bioscience, Inc基因、£基因美国2020.10.26 Xpert Omni SARS-CoV-2Cepheid E基因、/V基因美国2020.11.27
R N A，当它与反应混合物中的P H指示剂耦合时，可以 通过颜变化定性获得检测结果。目前，全球批准上 市了多个基于R T-L A M P的新冠病毒检测产品。截至 2020年12月7日，我国已上市的24件新冠病毒核酸 检测试剂中，基于R T-L A M P技术的产品为2件；美国 已上市的196件新冠病毒核酸检测试剂中，基于R T-K A M P技术的产品为10件（表2)。杭州优思达生物技 术有限公司的新型冠状病毒2019-n C o V核酸检测试剂 盒（恒温扩增-实时荧光法）是国内首个新冠分子即时检 测（P O C T)试剂，需配套该公司全自动核酸分析仪使用，可现场进行快速检测，实现核酸提取、扩增、检测全自动 —■体化。Sherlock BioSciences和 M a m m o t h Biosciences 的 产品均结合了 C R I S P R检测技术，
提供了更简单的工作 流程和更快的周转时间，初步研究结果显示其特异性可 达到100%1111。在检测速度上，雅培的ID N O W C0V I D-19检测试剂获得关注，该产品仅需5m i n即可得到阳性 结果，13m i n即可得到阴性结果，但近期的多项研究结果 显示该产品具有极高的假阴性率‘12\
1.2.2 转录介导的扩增技术转录介导的扩增(transcription mediated amplification，T M A)技术是利用R N A聚合酶和逆转录酶在约42丈的等温反应条件下进行扩增R N A的系统，允许在恒定温度下在单个反应 管中运行整个扩增反应。T M A敏感度高、检测简便、适 合高通量筛选，在细菌和病毒的快速检测中发挥了重要作用[B]。截至2020年12月7日，美国共有4款基 于T M A技术的新冠病毒分子诊断产品上市，均为定性 诊断，分别来自 Poplar Healthcare、PrivaPath Diagnostics、Quest Diagnostics Infectious Disease 和 Hologic 四家公司，中国尚未有基于该技术的诊断产品上市（表
1.2.3基于C R I S P R的诊断技术成簇的规律间隔的 短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats,C R I S P R)是一类独特的正向重复序 列家族，最早（1987年）在大肠杆菌中发现，C R I S P R及其相关蛋白是微生物体内的一种R N A指导的适应性 免疫系统。2013年起，C R I S P R技术以出众的基因编辑 能力闻名于世，但这项技术的应用范围不仅限于基因编辑。早在2016年，Jennifer D o u d n a团队就将该技术 用于R N A检测，由于灵敏度较低而未广泛应用14。
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表2基于RT-LAMP的已上市新冠病毒检测产品例举
Table 2 Examples of SARS-CoV-2 detection products based on RT-LAMP
产品名称生产企业批准国家批准时间
新型冠状病毒2019-n C o V核酸检测试剂盒
(恒温扩增-实时荧光法）
杭州优思达生物技术有限公司中国2020.3.16
新型冠状病毒2019-n C o V核酸检测试剂盒
(双扩增法）
武汉中帜生物科技股份有限公司中国2020.3.31 ID N O W C O V I D-19Abbott Diagnostics Scarborough, Inc.美国2020.3.27
i A M P C O V I D-19 Detection Kit Atila BioSystems, Inc.美国2020.4. 10 Sherlock C R I S P R S A R S-C o V-2 Kit Sherlock BioSciences, Inc.美国2020.5.6 Color G e n o m i c s S A R S-C o V-2R T-L A
M P
Diagnostic Assay
Color Genomics, Inc.美国2020.5. 18
A Q-T O P C O V I D-19 Rapid Detection Kit Seasun Biomaterials, Inc.美国2020.5.21
C u e C O V I D-19 Test C u e Health Inc.美国2020.6. 10
S A R S-C o V-2 R N A D E T E C T R Assay U C S F Health Clinical Laboratories, U C S F Clinical Labs at
China Basin
美国2020.7.9 P r o-A m p R T S A R S-C o V-2 Test Pro-Lab Diagnostics美国2020.8. 13
S A R S-C o V-2D E T E C T R Reagent Kit M a m m o t h Biosciences, Inc.美国2020.8.31 MobileDetect Bio B C C19( M D-B i o B C C19 )
Test Kit
Detectachem Inc.美国2020.9.1
表3基于T M A的已上市新冠病毒检测产品例举
Table 3 Examples of SARS-CoV-2 detection products based on TMA
产品名称生产企业批准国家批准时间Aptima S A R S-C o V-2 Assay Hologic，Inc.美国2020.5. 14 LetsGetChecked Coronavirus( C O V I D-19)Test PrivaPath Diagnostics, Inc.美国2020.5.28 Quest Diagnostics H A S A R S-C o V-2 Assay Quest Diagnostics Infectious Disease, Inc.美国2020.7.15 Poplar S A R S-C o V-2 T M A Pooling Assay Poplar Healthcare美国2020.8.3
2017年4月，张锋团队在Sde/ice杂志发文公开了基于 CRISPR/Casl3的病毒检测技术，张锋利用C a s l3蛋白 的活性将其改进，取名为SHERLOCK (specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking) ，相比于传统 RT-PCR检测，SHERLOCK检测技术准确度更高，价格和检 测所需时间减少了一半[15]。2020年2月14日，张锋团 队发布了使用基于CRISPR/Casl3的SHERLOCK技术检 测新冠病毒的详细操作流程文档。2020年9月17日，张 锋团队在 W eM;J o u m a/qfMet/icine发文公布了升级版基于SHERLOCK技术的新冠病毒检测流程—STOPCovid. V2W。2020年5月6日，FDA通过紧急使用 授权了 Sherlock Biosciences 公司基于 SHERLOCK 技术 的新冠病毒检测试剂盒，这是美国FDA授权的首款该类 型试剂盒。另外，Jennifer Doudna也利用C asl2蛋白开发 了新型的病毒感染诊断工具，并结
合等温核酸扩增技术提高了灵敏度，该技术被称为DETECTR (DNA endonuclease-targeted CR丨SPR trans reporter)，据称单次检 测成本不到1美元，用时l h[m。2020年8月31日，Jennifer Doudna 创立的企业 Mammoth Biosciences 的新冠 检测试剂 SARS-CoV-2 DETECTR Reagent Kit 同样获得 FDA的授权批准上市。目前，CRISPR主要与等温核酸 扩增技术结合形成相关产品，该技术在即时诊断（POCT)产品研发领域有广阔的应用前景。
1.2.4 滚环扩增技术滚环扩增（rolling circle amplification，R C A)技术在新冠病毒的核酸检测中获得 关注[l8]，R C A可在恒温条件下用最少的试剂进行操作，并且避免了假阳性结果的产生。R C A在新冠病毒检测中的使用仍处于初级阶段，丹麦技术大学Tian 等19验证了一种特定的R C A技术----circle-to-circle amplification ( C2C A)在新冠病毒感染检测中的价值，
154中国生物工程杂志China Biotechnology Vol.41 No.2/3 2021
耗时约l O O m i n。截至2020年12月7日，全球尚无基于R C A技术的新冠病毒诊断产品上市：
1.3微阵列技术
微阵列技术是一种快速且高通M的检测方法，在该 方法中，病毒R N A通过逆转录产生用特定探针标记的 cDNA，与固定在微阵列上的固相寡核苷酸杂交，通过检 测特定探针来检测冠状病毒RNA。由于
其快速、高通量 的优越性，微阵列分析已广泛用于冠状病毒的检测。目前，已有研究验证了微阵列技术在SAR S冠状病毒突变 体识别中的有效性，并已用于检测多达24个与SARS冠 状病毒Spifce基因相关的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP )突变，准确率可高达100%[20]。随着C0VID-19疫情的发展，检测新冠病毒变 异株的能力非常重要，而微阵列分析为快速检测这些变 异株提供了平台。目前，尚未有针对新冠病毒的R N A微 阵列检测产品上市，但在蛋白质微阵列领域，已获得了初 步成果，加州大学尔湾分校H e d d e等1〜开发了一种“综 合微阵列新冠肺炎检测技术”（comprehensive coronavirus micTOarray)，可通过一次性检测多个抗体检测14种呼吸 道病毒，极大地提升了检测的准确性。
1.4高通量测序技术
用于新冠状病毒的测序技术主要包括传统的S a n g e i■测序二代测序、宏基因组测序等，这些测序技术 虽然具有极高的精确度，但操作复杂、检测时间相对较 长，在新冠病毒的检测上仍无法实现大范围推广、快速 诊断的目的:22]。在这些技术中，宏基因组测序在新冠病毒的鉴定中起到了重要的作用。宏基因组测序(m N G S)将宏基因组学与二代测序技术相结合，无须培 养、无偏好性，是目前临床上针对病原最常用的基因测 序方法，可一次性完成细菌、真菌、病毒和寄生虫等多种病原体检测。在本次疫情中，t n N G S利用其技术优势，在5天内就鉴定并分析出新冠病毒的基因组，而2003年S A R S的鉴定耗时5个多月[3]。总体来看，m N G S对病原广覆盖的特点不但使其对于新冠病毒这 类新发病
原体的快速鉴定具有其他方法学无可比拟的 优势，还可以同时为其他病原和混合感染的精准诊断提供依据，因此，m N G S可与实时荧光定量P C R技术联 合使用，实现优势互补。对于R T-P C R检测阴性，但临 床表型高度疑似的患者，利用m N G S进一步确认可有 效提高检测结果的可靠性，并获得是否有其他病原体感染的信息。此外，纳米孔测序法等三代测序技术也在新冠病毒的检测中得到应用,2020年3月，武汉大学 药学院W a n g等™开发了纳米孔靶向测序检测方法(N T S)，能大幅提升新冠病毒阳性检出率，且该项检测 所需的纳米孔测序平台要求不高，在小型测序仪M i n l O N上即可完成检测。
截至2020年12月7日，我国已上市的24件新冠 病毒核酸检测试剂中，基于高通量测序技术的产品为1件；美国已上市的196件新冠病毒核酸检测试剂中，基 于高通量测序技术的产品为6件（表4)。从已上市的 产品来看，我国华大基因的新型冠状病毒2019-n C o V 核酸检测试剂盒采用了该公司专利技术联合探针锚定 聚合（c P A S)测序技术，需配套华大基因相关基因测序 系统使用。而美国的6件产品中，1^以0^10-19~03 Test、lllumina C O V I D S e q Test、Guardant-19 与 U C L A SwabSeq C O V I D-19 Diagnostic Platform均采用的是二代 测序技术；BillionToOne 的 qSanger-C O V I D-19 Assay 是 一种基于该公司利技术的开放式检测试剂，可采用任何实验室的S a n g e r测序仪。值得一提的是，Clear U b s 的 Clear D x S A R S-C o V-2 Test于 2020 年 9 月23日获得美国F D A紧急使用授权（E U A)，成为全球首 个获F D A认证的基于单分子测序（nanopore sequencing-based test)新冠病毒检测技术。
表4基于高通量测序技术的已上市新冠病毒检测产品例举
Table 4 Examples of SARS-CoV-2 Detection Products based on high-throughput sequencing 产品名称生产企业批准国家批准时间新型冠状病毒2019-n C o V核酸检测试剂盒（联合探
针锚定聚合测序法）
华大生物科技（武汉）有限公司中国2020.1.26 lllumina C O V I D S e q Test lllumina, Inc.美国2020.6.9 Helix C O V I D-19 N G S Test Helix O p C o L L C (dha Helix)美国2020.8.6 Guardant-19Guardant Health,Inc.美国2020.8.21 q S a n g e r-C O V I D-19 Assay BillionToOne, Inc.美国2020.9.4 Clear D x S A R S-C o V-2 Test Clear Labs, Inc.美国2020.9.23 U C L A S w a b S e q C O V I D-19 Diagnostic Platform University of California, Los Angeles (U C L A)美国2020.10.6

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