新型纳米流控芯片技术实现外泌体药物载体的高通量制备
新型纳米流控芯片技术实现外泌体药物载体的高通量制备
高通量纳米流控芯片实现外泌体装载药物并杀伤肿瘤
近日，中国科学院深圳先进技术研究院研究员杨慧团队研发出一种纳米流控芯片技术，实现了外泌体药物载体的高通量制备，并实验验证了新型外泌体药物载体的抗肿瘤效果。最新研究成果以A high-throughput nanofluidic device for exosome nanoporation to develop cargo delivery vehicles为题，发表在Small上，并被选为当期封底文章。
外泌体是几乎所有细胞类型都能分泌到细胞外空间或体液中的纳米级颗粒，直径大约为30~200纳米，其作为一种天然的细胞间物质载体，通过生物分子的转移和传递来实现细胞间的通讯，已被用于人类疾病的药物分子的天然递送载体，在智能药物递送领域具有应用潜力。
然而，传统方法将外源物质装载到外泌体中如电穿孔方法，装载效率过低且极易破坏外泌体的完整性和功能性，使得外泌体在生物医药应用上面临挑战。为此，杨慧团队提出名为“外泌体纳米穿孔器 （Exosome nanoporator）”的高通量芯片，可将多种外源物质装载到外泌体中，并获得大量装有药物的外泌体样品。
“外泌体纳米穿孔器”借助纳米流体芯片技术可在纳观尺度精确控制流体的特点，实现外泌体药物载体制备条件的高度可控。基于MEMS微纳制程工艺，制造结构精密的纳米级通道，实现30,000个模块并行工作，可提高制备效率。通过机械挤压和流体剪切的耦合作用，在外泌体膜表面产生短暂存在且不破坏生物膜结构的纳米孔，促进外源物质分子从周围溶液进入外泌体，从而实现了外泌体药物载体的无损伤制备。
如果将细胞比喻为生产生物分子的工厂，那么外泌体就是携带这些分子的运载器，它们能够直接进入受体细胞内部，释放所携带的物质，进而影响受体细胞。近年来，外泌体被用于探索人类疾病的药物分子递送载体，在药物研发领域表现出较大的应用潜力。
如果将细胞比喻为生物分子工厂，那么外泌体则是这些分子的运载器，能够直接进入受体细胞内部释放所携带的物质，进而影响受体细胞。近年来，人们不断探索外泌体作为天然载体递送药物分子的应用潜力。中科院深圳先进技术研究院研究员杨慧团队研发了一种纳米流控芯片技术，实现了外泌体药物载体的高通量制备，并验证了新型外泌体药物载体的抗肿瘤效果。最新研究成果近日以封面文章的形式发表于《微尺度》。
据杨慧介绍，外泌体的直径大约为30～200纳米，作为一种天然的细胞间物质载体，可以
分泌到细胞外空间或体液，通过生物分子的转移和传递，来实现细胞间的通讯。
外泌体直径大约为30~200纳米，是一种天然的细胞间物质载体。但外源物质装载到外泌体中的传统方法，如电穿孔方法，一直存在装载效率过低且极易破坏外泌体完整性和功能性的缺点。
为应对这一挑战，杨慧团队研制出一种名为“外泌体纳米穿孔器 ”的高通量芯片，可将多种外源物质装载到外泌体中，并获得大量装有药物的无损伤外泌体样品。
此成果论文第一作者、中国科学院深圳先进技术研究院博士研究生郝锐说，“外泌体纳米穿孔器”借助纳米流体芯片技术，可以实现外泌体药物载体制备条件的高度可控。
据他介绍，研究团队制造了结构精密的纳米级通道，实现了3万个模块的并行工作，可极大提高工作效率。借助纳米通道，研究团队对外泌体进行机械挤压和流体剪切，在外泌体膜表面，产生短暂存在但不破坏生物膜结构的纳米孔，促进外源物质分子从周围溶液进入外泌体，从而实现了外泌体药物载体的无损伤制备。
研究团队为进一步验证“外泌体纳米穿孔器”的有效性，选取阿霉素作为验证对象。阿霉素作
为一类抗生素类药物，常作为脑胶质瘤、恶性淋巴瘤、乳腺癌以及肺癌等各类癌症的药物。
最终，研究团队证实了“外泌体纳米穿孔器”可以将其高效装载到外泌体中，载药外泌体可以将阿霉素，运输到肺癌细胞和肿瘤球中，并诱导癌细胞死亡和抑制肿瘤球生长。
“研究结果表明，我们开发的纳米流控芯片，确保了含药外泌体的活性，同时架起了对抗癌细胞、肿瘤细胞等的'直击通道’，在不产生免疫反应的情况下释放内含药物，这是外泌体药物临床应用的重要前提。”杨慧说。
目前，研究团队正在努力将这一纳米流控系统进行标准化生产。杨慧介绍，未来，基于纳米流控芯片技术，实现外泌体载药的新策略，有望发展成为一个平台型工具，将具有生物学意义和临床作用的不同外源物质装载到外泌体中，在生物学研究和无细胞方法开发上得到更多应用。
同行进展
美国南加州大学附属洛杉矶儿童医院的科研团队，建立了一种3D生物反应器高效生产羊膜
干细胞EVs的方法，并且发现生产的EVs比2D培养皿生产的EVs具有更高的生物活性，产量可支持CGMP兼容系统的临床应用。
该团队利用两种方法培养人羊水干细胞（Amniotic Fluid Stem Cell, AFSC），并收集EVs：
1.3D中空纤维培养系统收集的EVs（3D EVs）
2.2D培养皿培养羊水干细胞收集的EVs（2D EVs）
将收集的EVs进行产量、效能特性及潜力比较。
生活中哪些是纳米技术方法
在2D培养皿（145cm2）上接种1×106 hAFSC细胞，FiberCell小型培养筒（#C2025D, 20 kD MWCO, 450 cm2）先用fibronectin包被，再接种1.6×107 hAFSC，用含20%胚胎干细胞专用胎牛血清的羊水培养基培养。培养皿饥饿培养24小时后收集EVs，第5天将HFBR纤维管外空间血清取出，仅在纤维管内空间中循环，测试收集频率的影响（1小时，24小时）。
通过颗粒浓度分析、效能测定、鉴定（Exoview分析）和效果（慢性肾脏疾病Alport综合征小鼠模型的体内实验）比较2D EVs和3D EVs。
结果
01 收获EVs产量及粒径浓度分析
2D收获EVs总量为2.8x1010，体积为20ml，浓度为1.4x109EV/ml。3D HFBR收获的EVs浓度约2.8×1010EV/ml（4*24小时收获），及4.4x1010EV/ml（2天内每小时收获），每次收获体积为2ml。在每小时收获的2天内，共收集到50ml，2.2x1012个EVs。
结论
3D EVs和2D EVs具有类似的性质，包括大小，效能，以及在慢性肾损伤模型的体内疾病缓解活性。除了四跨膜蛋白的表达差异，两种EVs均显示出体外效价和体内生物活性。
这是另一个例子
来自东南大学中大医院科研团队，今年发表在Stem Cell Research & Therapy上的文章，
也有同样的研究发现。该团队将2x108脐带分离的MSC，分别接种于2D培养瓶（T225）以及中型中空纤维培养筒（FiberCell，#C2011, 20 kD MWCO, 3000cm2），并收获EVs，比较了不同EVs的产量，特征以及效果。3D EVs比2D EVs的产量增加19.4倍，3D EVs的收获浓度是2D EVs浓度的15.5倍。在体内实验中，3D EVs可显著改善顺铂诱导的急性肾损伤，且比2D EVs有更强的肾脏保护功效。
来源：中国青年报客户端等

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