新型抗结核化合物体内外活性评价方法的研究进展
DOI: 10.3969/j.issn.1673-713X.2021.03.010·
综述·新型抗结核化合物体内外活性评价方法的
国外有名医学院研究进展
杨瑞芳，蒙建州，李传友
结核病（tuberculosis，TB）是由结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的慢性呼吸道传染病，是全球十大死因之一，也是由单一传染源导致死亡的主要原因，排名高于艾滋病。2019 年因TB 死亡的人数是120 万人[1]。MTB 具有特殊的生理特征，包括生长缓慢、自然状态下基因突变率较高以及用药后易形成持留菌株等，导致TB 用药周期较长、患者的依从性较差，因此耐药MTB 的检出率不断攀升。2020 年最新WHO 报告显示，全球2019 年估计有1000 万TB 新发病例，有近50 万人罹患利福平耐药结核病（rifampicin resistant tuberculosis，RR-TB），其中78% 患有耐多药结核病（MDR-TB）[1]。目前，由敏感菌引起TB 的方案是（INH）、利福平（RIF）、吡嗪酰胺（PZA）和乙胺丁醇（EMB）共同给药  2 个月，然后INH 和RIF 再给药4 个月，而耐药TB 疗程可达24 个月。漫长的周期也增加了耐药菌的出现概率[2-3]。我国是TB 高发国家，随着经济高速发展、人口流动性增大，TB 严重威胁着公共健康。科研者们致力于新型抗结核药物的筛选和研究，但进展却极为缓慢。近半个世纪以来只有贝达喹啉和德拉马尼两种对各类耐药MTB 有效的新药上市[4-5]，然而，这两种药物都具
有较强的心脏毒性，而且临床也很快发现了对这两种药物具有耐药性的MTB 突变菌株[6-7]。此外，普托马尼（PA-824）是美国FDA 于2019 年批准的TB 的药物，并同贝达喹啉（B）和利奈唑胺（L）组成BPaL 方案成人XDR-TB 和MDR-TB。但是，由于目前PA-824 TB 的临床试验和安全性存在一定的局限性，仍需进一步的研究提供更多的数据支持[8-9]。因此，开发新型抗结核药物，有效控制TB 已成为亟待研究的重要课题[10]。
目前获得新型抗结核药物研究策略主要采用高通量筛选模型获得一些对MTB 具有抑制活性的化合物，但是在基于靶标的分子水平筛选模型研究中，化合物通常缺乏针对整个细胞的活性，因此成功率较低[11-12]。而细胞水平的抑制剂筛选模型通常是以菌株的存活或生长为指标，直接获得具有抑菌活性的化合物样品。几乎全部的抗结核药物都是通过这种筛选方式获得[13-14]。这也表明全细胞表型高通量筛选技术主导了抗结核化合物的发现，采用这一研究策略更有可能获得具有开发前景的、具有全新作用机制的候选药物[15]。对通过全细胞表型高通量筛选获得苗头化合物进行体内外抗结核活性评价是评估化合物开发价值的重要环节。因此，本文就化合物体外和体内抗结核活性评价两方面进行阐述。1  抗结核体外活性评价
1.1  最小抑菌浓度
化合物通过抑制MTB 的生长或杀灭菌株而发挥抗结核作用。因此，化合物对MTB 菌株最小抑菌浓度
（MIC）成为评价化合物体外活性的一项非常重要的指标，可以快速评价样品的活性。目前，测定化合物MIC 的常用方法可以分为两大类，一是传统的固体培养基表型检测方法；二是液体培养基中MTB 的生长或能量代谢反应检测方法。
固体培养基检测方法以琼脂稀释法为代表，基本原理是将不同剂量的化合物加入Middlebrook 7H10 固体培养基中，制成含不同递减浓度梯度的平板，采用比例法进行实验。以不含有化合物处理组为阴性对照，培养三周后计算两组菌落生长数比值，能够抑制99% 或更高MTB 生长的药物浓度被认为是其最低抑菌浓度。但是，该方法培养周期较长，化合物容易降解，使结果偏高[16]。液体培养基常见检测方法是运用液体培养基对抗结核化合物进行倍比稀释，得到不同浓度的化合物，接种新鲜MTB（浓度约106 CFU/ml），培养  2 ~ 3 周后，肉眼观察菌的生长情况，以恰好无菌生长所对应的药物浓度为MIC。96 孔板法的使用，可控性好，结果准确[17]。但是，这种方法也存在一定的缺点，包括肉眼观察可能产生的误差，以及不能准确判断实验中的污染情况[18]。
近年来，在96 孔板法的基础上，培养基中加入氧化或还原试剂后继续培养24 h，在MTB 的代谢作用下发生还原反应，使颜发生变化。其显程度与培养基中的活菌数成正比，可以间接测定MIC[18]。最初用的显剂是噻唑蓝（MTT），在活细胞的代谢作用下还原为难溶性的紫结晶物沉积在细胞内，经DMSO 溶解后通过分光光度计测定（波长为590 nm）。近年来，Alarm Blue 显剂的发现，使越来越多的研究者们趋向于应用这种方法来检测MTB 的MIC，文献报道均显示具有较好的准确性和
重复性，因此被广泛使用[19-20]。
基金项目：国家自然科学基金（81803412）；中国医学科学院医学与健康科技创新工程（2016-I2M-1-013）；北京市临床重点专科项目
作者单位：101149 北京，首都医科大学附属北京胸科医院北京市结核病胸部肿瘤研究所细菌免疫室（杨瑞芳、李传友）；100050 北京，中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所国家新药（微生物）筛选实验室（蒙建州）
通信作者：李传友，Email：**************************
收稿日期：2020-11-06
此外，耐药菌的出现日渐成为未来抗结核研究中，特别是抗结核药物的研发重点。因此，在抗结核化合物前期药效学评价中，有必要测定化合物对临床耐药菌株以及MTB 对其产生耐药性频率。
1.2  最小杀菌浓度
目前，临床上抗结核菌的药物分为抑菌和杀菌两类，抑菌剂通过抑制细菌繁殖发挥作用，而杀菌剂则是破坏细菌细胞结构导致细菌死亡。通过体外试验确定药物致杀率在99.9% 左右，可以将药物归类为
杀菌药物[21-23]。最小杀菌浓度（MBC）的检测方法通常是在MIC 的检测结果基础上进一步实验。因此，在测定MIC 后，再配置7H10 培养基平板，在MIC 实验中无肉眼可见菌生长的孔内取部分菌涂7H10 平板，在37 ℃温箱里再培养  3 ~ 4 周，进行CFU 计数，CFU 减少99.9% 孔内对应的化合物浓度即为MBC。国外一项研究将MTB 有氧培养至对数相，接种于含4 种不同浓度化合物的含有20% 吐温80 和OADC 的7H9 培养基中，化合物在固定浓度下进行测试，在没有可用的MIC 数据基础上，将培养物暴露于化合物中21 d，并在第0、7、14 和21 天通过计数琼脂平板上的菌落形成单位来测定细胞活力。MBC 被定义为21 天内达到2log 致死所需的最低浓度[24-25]。
1.3  对 MTB 生长曲线的影响
通过对MTB 标准株H37Rv MIC 和MBC 的测定，可以明确化合物对MTB 的抑菌和杀菌活性。在MIC 结果的基础上，滕丽艳[26]通过用1/4 MIC 化合物  E 处理H37Ra 菌株并绘制生长曲线，同时以正常培养的H37Ra 菌生长曲线做对照，发现化合物  E 在亚抑制浓度下，H37Ra 菌株仍在继续生长，只是速度减慢，进一步表明化合物  E 对MTB 的生长有抑制作用。因此，化合物对MTB 生长曲线的影响也可以作为新型抗结核化合物体外抗结核活性的一项重要的评价指标。
1.4  对持留态 MTB 活性的抑制
人们常将MTB 在宿主体内以非增殖方式存在而造成延缓性病程或导致复发的潜伏菌称为持留菌。而
持留菌的存在使感染患者体内细菌潜伏造成TB 病程迁延和复发，使TB 的面临挑战。目前所使用的抗生素中，除了吡嗪酰胺对持留菌有抑制活性外，其他大部分的药物只对复制期的MTB 起作用[23]。因此，寻对持留菌有效的药物是对抗结核病耐药问题、缩短用药周期的有效手段。Loebel 等[27]早在1933 年就发现在没有营养物的培养基中长期培养，或是在培养基和盐水中暴露于厌氧条件下一段时间后，MTB 生长会受到抑制而处于休眠期。此外，研究者们也发现其他许多因素，包括pH 值的变化，NO、CO、金属离子的过量和不足以及磷酸盐等营养物质的缺乏等也可能导致MTB 在宿主中的休眠状态。但是，目前为止，缺氧诱导和营养缺乏模型因较为简单，且容易操作而更为常用[28-29]。
在缺氧或不含甘油和OADC 的7H9 培养基中培养MTB 模拟持留状态，分别取培养3 周和2 个月的H37Rv 菌  5 ml 左右，振荡  2 ~ 3 min 打散后静止30 min 使菌沉淀，加入不同的EP 管并调节菌的浓度至OD600 = 0.1，取适量菌液加入两个含培养基的瓶中，至菌浓度为l × 106CFU/ml，各自加入浓度为2.5 mg/ml 的化合物和INH （阳性对照），不加化合物为阴性对照。37 ℃恒温温箱内孵育  3 d 后洗涤菌液并稀释成不同浓度涂7H10 平板，37 ℃恒温箱内培养3 ~ 4 周后CFU 计数，评价化合物对处于持留状态的结核杆菌是否具有杀菌作用[23]。
2  体内抗结核活性
2.1  传统动物模型对新型抗结核化合物的体内活性评价
药物进入机体发挥抗菌作用涉及药物对机体的作用以及机体对药物的代谢，评价化合物具有体内抑菌活性是新药研发过程的关键步骤，动物模型被证实对筛选新药以及更好地理解宿主-病原体关系是非常重要的，不同的动物模型在TB 研究中具有不同的优缺点。
小鼠由于价格低廉、遗传及免疫背景清楚、操作简单、T 细胞在MTB 感染免疫应答中的作用和人类一致等优点，成为制备TB 模型最常用的动物。但是，小鼠在初次感染后尽管疾病被控制，但MTB 量仍保持较高水平，导致疾病呈慢性进行性。此外，MTB 感染后缺乏人类的病理特征，如干酪样肉芽肿很少发展为坏死、液化及空洞，而且肺组织出现坏死性改变的时间较长、肺部荷菌量改变幅度较小，不利于对和保护作用进行评价，限制了小鼠在TB 研究中的应用[30-31]。而豚鼠感染MTB 后，可以形成坏死的原发性肉芽肿，因此，常用于TB 发病机制、病理和免疫的研究中[31]。郑梅琴等[32]通过构建豚鼠TB 模型，探讨、莫西沙星、氯法齐明、JYS-1 和JYS-2 的抗结核活性。国外一项研究应用SPF 雌性SD 大鼠MTB 感染模型，通过检测血清中的菌浓度评价苯并噻嗪酮的体内抗结核活性，发现苯并噻嗪酮是一种有效的临床耐药TB 的前候选药物[33]。Horváti 等[34]通过建立豚鼠结核感染模型，对抗结核新药乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA-pT8 进行了体内药物毒性和抗结核活性的检测。但是，豚鼠因感染MTB 后缺乏潜伏期，且价格较昂贵而存在一定局限性。
兔子感染MTB 后可形成干酪样肉芽肿，而且具有潜伏期，因此，也常用于TB 的研究。缺点是需要高剂量MTB 才能建立感染模型[35]。Rifat 等[36]利用兔结核感染模型，评估利福喷丁对不同类型TB 病灶
的渗透性，发现它对肺空洞病变的渗透性差，且部分解释了在II 期临床试验中，改善效果所需的剂量在大空洞患者中是无空洞患者的  4 倍。
斑马鱼发育周期短、繁殖产量高，与人类基因组具有相似性、具有良好的先天免疫系统以及适应性免疫应答系统的特点[37]，常被用作TB 模型和药物筛选工具。刘红旭等[38]通过建立斑马鱼-海分枝杆菌感染模型科学、有效地研究TB 的免疫病理机制，并在此基础上研发新型抗结核药物。国外多项研究也证实了斑马鱼在抗结核机制研究具有重要
的意义[39-41]。但是，斑马鱼缺乏TB 的主要感染器官，且自身并不能很好地清除感染菌，因此在实验研究中存在局限[37-38]。
果蝇繁殖快、成本低、操作简单，且有类似脊椎动物的吞噬细胞和固有免疫信号途径[42]，但缺乏T、B 细胞，因此，可以作为研究人对TB 的固有免疫反应的模型，且需要在哺乳动物中进一步验证[43]。Pushkaran 等[44]通过建立MTB 感染果蝇模型显示了阿莫西林-克拉维酸和地奥司明作为一种协同的联合TB 的潜力。
2.2  小动物活体成像技术在新型抗结核化合物体内活性评价的应用
小动物活体成像技术是近几年发展起来，可应用于MTB 在活体内对新型抗结核化合物的反应进行观察。
与传统动物实验相比，该技术可以对同一实验对象持续观察，避免因多个时间点造成的个体差异，减少动物的使用量，而且具有更高的灵敏性，可以在感染早期便进行活体观察，从而筛选出药物的最佳剂量以及给药浓度和时间，还可观察记录不同剂量药物对活体的毒副作用，更便捷地评估药物效力[45]。目前，生物发光实验因其特异性强而用于小动物活体成像技术，它是在ATP、镁离子和氧气的参与下，通过底物荧光素与表达的荧光素酶反应产生生物发光的光子而发挥作用[35]，Arranz 和Ripoll[46]描述了生物发光实验可用于药物靶向分布的观察，从而进行药效学的评估。
3  小结
近几年来，MDR 和XDR 的不断出现和增加，全球范围内TB 形势愈加严峻。因此，开发新型高效的抗结核药物是有效控制TB 的主要策略，特别是筛选出具有抗耐药MTB 及持留状态MTB 的药物研究已经越来越引起人们的重视。然而，新型抗结核药物的研究是一个极其复杂且重要的过程，而体内外抗结核活性的评价是研究抗菌药物的第一步，也是必要的一步。本文综述了体外检测化合物对MTB 标准株H37Rv 和临床耐药菌株的MIC、MBC 和体外制备持留菌检测化合物对潜伏状态MTB 的抗结核活性，以及多种临床前动物模型的建立来评价体内抗菌活性等方法。然而，很多研究如化合物与INH、RIF 等一线抗菌药物的联合和交叉抗结核活性，以及细胞毒性评价方法等需要进一步的探究，从而减少耐药菌以及毒副作用的出现。此外，目前新型抗结核化合物多采用胞外检测抗菌活性，而MTB 侵入机体后，巨噬细胞的吞噬作用是极为重要的抗菌免疫应答机制，因此，检测化合物对胞内MTB 的影响也是
非常必要的。综上所述，尽管新型抗结核化合物的体外活性体系仍需要完善，但是通过经典的MIC、MBC 检测方法评价新型抗结核化合物的体外抗菌活性及处于休眠期MTB 的抑制活性，使其可作为未来抗结核药物候选物的先导化合物，从而保证后续新型抗结核药物的顺利研发，仍然具有十分重要的意义。参考文献
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