青蒿素研究进展及合成方法
摘 要 青蒿素(artemisinin)是我国自主开发的强效、低毒、无抗性抗疟特效药，尤其是脑型疟疾和抗氯 喹恶性疟疾的特效药。青蒿中的青蒿素含量在0．4％ ～ 1．0％之间，从天然青蒿中提取青蒿素难以满足市 场需求，而青蒿素化学合成的工艺复杂、成本高、毒 性大、产率低，至今未能实现工业化生产。目前。本文对自青蒿素发现以来的最新研究进展进行了比较详尽的综述。内容包括：中药青蒿和青蒿素的发现，青蒿素的来源，青蒿素的药理作用，青蒿素的全合成，青蒿素的生物合成，青蒿素衍生物以及植物组织培养生产青蒿素。
关键词 青蒿素；青蒿素衍生物；合成
青蒿素(artemisinin)是继氯喹、乙氨嘧啶、伯喹和磺胺后最热的抗疟特效药,尤其对脑型疟疾和抗氯喹疟疾具有速效和低毒的特点,已成为世界卫生组织推荐的药品。青蒿素的抗疟机理与其它抗疟药不同,它的主要作用是通过干扰疟原虫的表膜-线粒体功能,而非干扰叶酸代谢,从而导致虫体结构全部瓦解。目前药用青蒿素是从中药青蒿即菊科植物黄花蒿的叶和花蕾（Arte
misia annua L.）中分离获得的。由于青蒿的采购、收获,直至工厂加工提取,环节较多,费时费力,且不同采集地和不同采集期青蒿品质 有很大的差别,同时,大量采集自然资源,必然会破坏环境和生态平衡,导致资源枯竭。因此,为增加青蒿素的资源,世界各国都在加紧开展青蒿素及其衍生物的开发研究,长期稳定地和大量地供应青蒿素成为各国科学家面临的严峻考验。本文将对目前国际上青蒿素研究的现状从以下几个方面进行论述。
1.中药青蒿和青蒿素的发现
奎宁和氯喹这类药物对疟疾的成功没有延续太久, 20世纪 60年代开始出现了抗药性的疟原虫, 尤其是在东南亚和非洲地区, 甚至已到了无有效药物可用的地步。而当时的越南战争则更凸显这一问题的严重性, 热带丛林地区疟疾肆虐, 成为部队大量减员的主要原因。越南方面向中国提出了协助解决疟疾困扰的要求, 接受了这一要求, 确立了由全国多部门参加, 以疟疾防治药物研究为主要任务, 代号为“ 523”的紧急军工项目。为解决抗药性问题, 该项目除注意合成新化合物外, 更期望从中药中发现新的抗疟有效成分。在“523”项目的组织下, 各参加单位数年间筛选了数以百计的中草药药材, 从中获得了一批有效单体, 再根据抗疟活性、毒性和植物资源等方面的因素选出了青蒿素作为重点研究对象。中药青蒿
的抗疟作用虽然早在晋代葛洪的《 肘后备急方》的《治寒热诸疟第十六》中已经提及, 但药材青蒿所指的植物并不明确, 直至 1977年版的 中华人民共和国药典∀中还称包括青蒿(A rtem isia ap iacea Hance)和黄花蒿(A rtem isia annua L. )二种植物, 现在知道仅在黄花蒿中含有青蒿素, 而且黄花蒿中青蒿素的含量与产地大有关系, 欧美和中国北方乃至东部产的黄花蒿中青蒿素含量很低。即便中国西南地区产的高含量黄花蒿中, 青蒿素的含量也仅 0. 6% ~ 1. 1% 。相对于金鸡纳树皮中含有5% 的奎宁生物碱, 青蒿素的发现要困难得多。在 20世纪 60年代曾进行过中药青蒿的分离研究, 但未有所获, 可能是所取药材不对或提取条件不合适。1971年发现市售青蒿用乙醚提取得到的提取液残渣对鼠疟原虫的抑制率可达 100% , 而且在初步的临床试验中也取得了较好的效果。但是继续大量提取到的青蒿素 临床效果却不佳, 也许与其前后采用的药材产地不同有关。幸运的是, 不久之后用石油醚或乙酸乙酯从黄花蒿中提取到了高效的抗疟单体, 称之为黄花蒿素或黄蒿素, 即现在的青蒿素。研究还发现四川青蒿素是从什么植物中提取出来的, 现重庆酉阳产的黄花蒿含有较其他地区高得多的青蒿素, 以致于后来在酉阳建立了我国第一家吨级规模的青蒿素生产厂。1973年分离出青蒿素单体后开展的药理和临床研究证明, 青蒿素对疟原虫尤其是对抗药性虫株有极高的杀灭作用, 但是它的化学结构却在两年多以后才最后得到完全的确证 。1975年初, 根据当时测得的波谱数据和综合化学反应研究
结果, 已经能得出结构的大致状况,如青蒿素是分子式为C15H22O5的倍半萜内酯化合物, 不含羟基和双键。其分子结构如图1所示,其绝对构型由刘静明等通过旋光散和氧原子的反常散射测定。
图1 青蒿素结构式
以后在另一抗疟天然产物鹰爪甲素( yingzhaosu A )是过氧化合物这一信息启发下 , 通过定性和定量分析, 证明青蒿素也是一个过氧化合物。再参考南斯拉夫从同一植物中分离出的属倍半萜杜松烷( cadinane) 类型的青蒿乙素( arteannuin B)结构 , 提出了过氧基团处于内酯位的可能结构, 为当时生物物理所的计算提供了有益的参考。完整的、确切的青蒿素结构最
后是由生物物理所在化学推断的基础上, 于 1975年底通过单晶X 光衍射分析才确定下来的; 1978年再由反常散射的X光衍射分析最后确定了青蒿素的绝对构型。在青蒿素发现历史上有一个小插曲。1979 年青蒿素的结构公开报道后, 当年从A rtem isia annua L. (黄花蒿) 中分离出青蒿乙素的南斯拉夫化学家曾一再声称, 他们当时除青蒿乙素外也已分离得到了青蒿素, 只是因没有确切地定下结构才未正式报道。对此他们很遗憾, 错失了这一重大发现。据我们事后看到的他们登在国际会议论文集上的摘要 , 他们报告了一新化合物, 并认定其为一臭氧化合物( ozn ide of dihydroarteannuin)。现在看来, 此化合物的分子式虽然与青蒿素相同, 但另一些数据和化学反应情况则与青蒿素有所出入。其实, 他
们从贝尔格莱德地区所采集的黄花蒿中青蒿素含量很低, 分离的难度较高; 更重要的他们是从事纯天然产物方面的分离与结构分析, 即便发现了青蒿素, 也不可能知道它是新一代的抗疟活性化合物。
2.青蒿素的来源
青蒿素在抗疟中日益显示其重要性,寻其新的来源显得非常重要。目前,商用的青蒿素主要来自植物提取物。从青蒿中提取的青蒿素已成为世界卫生组织推荐的抗疟药物。在天然植
物中青蒿素的含量受地理环境、采集时期、采集部位、气温和施肥等因素的影响。青蒿广泛分布在中国的各省市,不同产地青蒿素含量差异显著,最高可达干重的1%—2%。为获得最大的青蒿素产量,钟风林等对不同生长期的青蒿素含量变化进行考察,认为青蒿的采集期在生长盛期至花蕾期之前,此时的青蒿素含量最高,营养体重量大,而且采集的时间以晴天中午12时及下午16时为宜,一天中在这期间采收青蒿素含量最高,这与光强有利于青蒿素的产生和大量积累理论相一致。在青蒿植株和枝条上的叶片中,青蒿素含量均呈下部、中部、上部依次递增的规律。因此,青蒿植物的上部和枝条上部的叶片应首选入药,其次为中部,最后才是下部。不同的干燥方法对青蒿素的产量也有一定的影响,比较晒干、阴干和60℃烘干三种方法,以自然晒干的效果最好,比阴干的样品含量高23.76%。在人工栽培中稍加肥料,青蒿植株高大,青蒿素的含量较野生的略高, 且嫩叶比老叶的含量高。陈福泰在人工控制的环境中栽培青蒿,在青蒿生长的基本条件得到满足的情况下,生长环境中的营养物质的含量与生长基质对青蒿素含量没有影响,而高温和短距离光照可促使青蒿素含量成倍增加。Elhag等 筛选高产的青蒿植株时,发现青蒿的含量高的植株具有长的节间,茁壮的茎杆,伸展开的枝条和茂密的叶。 Liersch等对筛选的青蒿品种811喷洒植物激素chlormequat,结果植株的青蒿素含量比对照高30%。虽然青蒿素主要来自于天然采集的野生植株和人工栽培青蒿,但
天然野生青蒿受地理环境和季节的限制以及资源的日益匮乏,难以获得持续的发展。人工栽培占地大,耗时耗力,且植株易变异,也使得产量难以保证,因而开发新的青蒿素来源途径具有重要的实际意义。
3. 青蒿素的药理作用
青篙索是我国唯一得到国际承认的具有自主知识产权的抗疟新药。它发挥药理作用分两步：①活化：青蒿素被疟原虫体内的铁催化，其结构中的过氧桥裂解，产生自由基；②烷基化：第一步所产生的自由基与疟原虫蛋白发生络合，形成共价键．使疟原虫蛋白失去功能。从而死亡。
青蒿素药理作用大致可分为以下几类：
①抗疟作用——通过产生自由基．对恶性疟原虫红内期的生物膜产生严重破坏作用。或与原虫蛋白结合，使之死亡。
②抗卡氏肺孢子虫肺炎作用——青蒿素主要破坏卡氏肺孢子虫膜系结构．引起孢子虫滋养体胞浆及包囊内出现空泡．线粒体肿胀．核膜破裂，内质网肿胀，囊内小体溶解破坏等超
微结构的改变。
③抗孕作用——青蒿素类药对胚胎有较高的选择性毒性．较低剂量即町使胚胎死亡而导致流产，有可能被开发为人工流产药物。
④对肿馏的作用——双氧青蒿素对白血病、黑素瘤、结肠癌、前列腺癌和乳腺癌细胞株高度敏感。
⑤抗血吸虫作用——其抗血吸虫活性基团是过氧桥，其药用机理是影响虫体的糖代谢。
⑥弓形虫感染作用——青蒿素主要作用于虫体细胞膜、线粒体及细胞核，继而广泛损伤其膜系结构，造成核膜断裂、线粒体肿胀、李泡样变性、内质网扩张甚至出现核碎裂、核溶解现象。
⑦对心血管的作用——青蒿索能明显对抗结扎冠脉引起的心律失常。町使氯化钙、氰仿引起的心律失常发作时间明显推迟．室颤明显减少。
⑧抗纤维化作用——与其抑制成纤维细胞增殖，降低胶原合成。抗组胺促胶原分解有关。
⑨对免疫系统的作用——青蒿素能减少原虫感染动物IgG含量．使脾脏蕈带减轻，血中补体白和血清总补体含量降低，控制血空斑和玫瑰花结形成细胞。
⑩其它作用——双氢青蒿素对杜氏利什曼原虫有显著抑制作用并呈剂量相关性。青蒿提取物还可杀灭阴道毛滴虫和溶组织阿米巴滋养体。
4.青蒿素的化学合成
化学合成青蒿素这一复杂的天然分子是有机化学家所面临的挑战。中国科学院上海有机所对青蒿素及其一类物的结构和合成进行了大量的工作。1986年, Xu等 报道了青蒿素的全合成途径,其合成以R(+)-香草醛为原料,经十几步合成青蒿素,合成途径如图2所示。国外也以不同原料为出发点进行青蒿素一类物的化学合成研究。1994年,Zhou和Xu综述了国内外青蒿素全合成的研究进展。青蒿素全合成研究虽已取得一些明显的进展,但到目前尚未显示出商业的可行性。
图2 青蒿素化学合成途径
5.青蒿素的生物合成
了解青蒿中青蒿素的生物合成途径与该药的生产密切相关。包括：(1)通过添加生物合成的
前体来增加青蒿素的含量；(2)通过对控制青蒿素合成的关键酶进行调控,或者对关键酶控制的基因进行激活来大幅度增加青蒿素的含量；(3)利用基因工程手段来改变关键基因以增强它们所控制酶的效率。
由于萜类化合物的生物合成途径非常复杂,因而对于青蒿素这一类低含量的复杂分子的生物合成研究就更具复杂性。对于倍半萜内酯的合成,其限速步骤一是环化和折叠成倍半萜母核的过程,另一个限速步骤为形成含过氧桥的倍半萜内酯过程。Akhila等通过放射性元素示踪法对青蒿素的生物合成途径进行了研究,认为青蒿素的生物合成途径如图3所示,从法尼基焦磷酸出发,经牦牛儿间架(germacrane)、双氢木香交酯(dihydrocostunodile)、杜松烯内酯(cardinanolide)和青蒿素B(arteannuin B),最终合成青蒿素。国内也进行青蒿素生物合成的研究,探索了由MVA为前体生物合成青蒿酸,以及由青蒿酸为前体生物合成青蒿素及青蒿素B的过程。
图3 青蒿素生物合成途径
6.青蒿素衍生物合成
青蒿素由于存在近期复燃性高,在油中和水中的溶解度低,难以制成合适的剂型等不足,对其结构进行改造,寻合适的青蒿素衍生物工作成为当今研究的热点。目前,已发现不少抗疟活性更高的衍生物,这些化合物主要是对青蒿素的12位碳原子进行修饰。梁洁等将青蒿素还原为二氢青蒿素,对二氢青蒿素的第12位碳原子进行修饰,合成了青蒿素芳香醚衍生物, 这些化合物除具有高效的抗疟活性外,还具有抗病毒和抗肿瘤的活性。李英等首先将青蒿素（I）催化氢化形成二氢青蒿素（II）,以此为中间体,在酸和碱的催化下与各种醇、羧酸酐和氯甲酸酯反应,合成其醚类（III）、羧酸酯（IV）和碳酸酯类（V）等衍生物47个,如图4所示。经筛选,以SD90作为标准,获得超过青蒿素效率10倍的化合物12个。经过几年的研究,目前国内已进行了青蒿素衍生物工业化生产。昆明制药厂与中国科学院上海药物研究所合作研制成功青蒿甲醚系列产品,并制成注射液、复方片剂和胶囊,其中青蒿甲醚注射液成为我国第一个在国际上获得注册的新产品,产品已远销缅甸、泰国、加蓬、多哥、南非和加纳等27个国家,出口创汇突破500万美元。
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