摘要：目的：建立一种基于纸基层析法的无醇病毒核酸提取方法。方法：通过简化传统离心柱操作方法步骤，更换核酸吸附材质为纸基片。操作简化为三个步骤：即①裂解样品1～3min 、②纸片吸附核酸与洗涤1min ；③洗脱1min ，整个提取操作过程约5min 左右完成。经实时荧光RT-PCR 验证纸基层析法核酸提取效果。结果：与常规的磁珠法病毒核酸提取方法对照组比较发现，本方法提取效率更高，操作步骤更简单且省时。结论：纸基层析法提取病毒核酸是一种快捷的方法，不需要额外离心机和磁力装置，快速实现了病毒DNA 和RNA 共提，整个操作过程中不加入乙醇或异丙醇，安全、无氯仿苯酚等有毒试剂污染，为我国欠发达地区基层防疫检疫部门的核酸检测工作提供了一种经济实用方法。
关键词：病毒核酸提取；纸基层析；
RT-PCR doi:10.3969/j.issn.1008-4754.2023.07.064
纸基层析快速提取病毒核酸方法的建立与分析
瓮珍珠，金祥瑞，唐诗，段文龙，高慎阳，张利勃*（锦州医科大学畜牧兽医学院辽宁锦州121001）
收稿日期：2022-11-19
基金项目：锦州医科大学2020年大学生创新创业训练计划项目（项目编号：20201016059）。
作者简介：瓮珍珠（1999.10—），女，河南人，本科，主要从事动物医学专业工作。
*通讯作者：张利勃（1974.11—），辽宁人，副教授，研究方向：动物微生物与免疫学。
从复杂生物材料中高效、简便的提取目的核酸是分子检测和诊断技术的关键。目前病毒核酸纯化技术主要分为三种，分别为传统法、柱膜法和磁珠法。传统法包括常用的煮沸法和TRIZOL 裂解法，煮沸法提取的核酸纯度较低，对后续PCR 检测的灵敏度影响较大；TRIZOL 裂解法是利用变性剂和表面活性剂进行裂解病毒表面核衣壳结构释放出核酸，结合苯酚、氯仿抽提去除蛋白等杂质，然后用乙醇或异丙醇进行沉淀获得核酸，该方法步骤烦琐，耗时较长、单个样本约35~55min 完成一轮提取纯化[1]；柱膜法是用传统法升级改进的一种低pH 值、高盐以及含醇的条件下用硅胶膜对核酸进行吸附、然后通过离心将含有胍盐的乙醇溶液滤过硅胶膜时洗涤去除蛋白等杂质，再用70%~80%的乙醇溶液去除盐离子，然后自然干燥去除残留乙醇获得纯化核酸的方法。该方法操作优点是相对简便，提取的核酸纯度高，缺点是是不利于自动化操作、耗时仍然较长、单个样本约30~45min 完成一轮提取纯化。磁珠法与柱膜法类似，主要是用磁性微球替代柱膜吸附核酸，用磁力分离代替离心分离操作，该方法的优点是相对简便直观，且能够在仪器上进行自动化操作；缺点是磁珠吸附核酸的同时容易吸附杂蛋白等杂质获得高纯度的核酸比较困难，成本偏高，耗时仍然较长、单个样本约25~45min 完成一轮提取纯化[2,3]。为进一步提升病毒核酸提取效率、降低成本，本研究以滤纸片为基材进行核酸提取方法的改进。
1材料
1.1试剂48小时核酸证明需要纸质的吗
盐酸胍（美仑生物，Lot ：J0612A ），Tris （pH 8.0），（索莱宝，Cat#T8060），Triton X-100（中杉金桥，Lot ：16168），Tween-20（索莱
宝，Cat#T8220），蛋白酶K ，NaCl （天津天力化学试剂有限公司），
EDTA （BBI life sciences ，Lot ：E416BA0008），氢氧化钠（天津天力化
学试剂有限公司），HEV 假病毒颗粒（本实验室保存）[4]
。
1.2器材
精密分析天平、容量瓶、Whatman TM 滤纸片、高压灭菌器、
ABI7500fast 。
2方法
2.1裂解液和洗涤液的配制[2]
裂解液：1~1.5M 盐酸胍，30~50mM Tris （pH 8.0），50~100mM
NaCl ，5~10mM EDTA ，1%Tween-20（v/v ），40μg/mL 蛋白酶K 。
洗涤液：Tris （pH 8）10mM ，0.1%Tween-20（v/v ）。
2.2滤纸片的制备
将滤纸裁剪为约25mm 2的纸片或用打孔器制成直径为6mm
圆形片，干热灭菌后备用。
2.3病毒核酸的提取
将2μL 假病毒颗粒混入50μL 猪血清中作为人工模拟样
本[4]，按下述方法进行RNA 的提取，验证该提取方法的可靠性与灵敏性。于1.5mL 无RNA 酶的EP 管中将人工模拟样品与四倍体积的裂解液置于离心管中混匀裂解1~3min 。将无菌纸片投入裂解混合液中，室温孵育吸附1min ，用移液吸头或无菌镊子将纸片移入200μL 的洗涤液中轻轻震荡洗涤1min 。取出纸片放入加装层析棉1.5mL EP 管中去除洗脱液，之后经DEPC 无菌水洗脱得到病毒核酸（此步可省略）或直接放入配制好的反转录体系中进行cD -
NA 的合成，最终取2~5μL cDNA 模板进行PCR 核酸扩增。1）模拟样品准备：将2μL 假病毒颗粒混入50μL 猪血清中作
为人工模拟样本，不加假病毒颗粒的血清为空对照。
2）裂解：向1）中各管分别加入200μL 裂解液然震荡混匀室温作用1~3min 。
3）吸附：将2）各管裂解样本分别滴加到纸基层析纸片中央（纸
129
Copyright ©博看网. All Rights Reserved.
中国动物保健2023.07
实践案例
片放入加装层析棉的1.5mL EP 管），逐滴加入待完全吸附。
4）洗涤：向3）各管分别逐滴加入200μL 洗涤液。5）洗脱：将4）中纸片分别转移至新的1.5mL 管中，分别加入
洗脱液50μL 获病毒核酸。
2.4病毒基因的检测
取上述核酸提取物5μL 放入配制好的反转录体系中进行
cDNA 的合成，最终取2~5μL cDNA 模板进行PCR 核酸扩增。
1）所用PCR 扩增引物与探针如表1中所示[5]。
2）RT-qPCR 反应体系和程序如表2中所示。
3结果
利用检测Ct 值评价本方法与参与方法的提取效果，实验结果
如表3和图1所示，RT-qPCR 检测的Ct 值记录。
由图1和表3可以看出，本提取方法提取得到的HEV 假病毒核酸浓度比对照组提取方法中的高（因Ct 均值更小），而且重复性接近（CV 值均<5%）。
4讨论
与对照组试剂盒相比，本研究建立的纸基层析法的病毒核酸
提取血清中病毒核酸的效率更高。检测Ct 值均值（11.89）优于对照
组（14.6），统计差异极显著（P<0.01，独立T 检验），表明本方法的病毒核酸提取浓度更高。另外，本方法整个过程在10min 内完成，效率优势明显，且进行病毒核酸提取过程中无需贵重仪器、实验成本相较现有方法明显降低，适合向临床即时诊断（POCT ）方向推广发展；本提取方法具有快速、高效且简易等优点，完全满足后续PCR 或RT-PCR 等分子检测要求[1,2]。与已有技术相比，其技术进步是显著的，采用独特的简易纸基层析介质和无醇裂解液和洗涤液，三步法最终获得高质量的病毒核酸分子（DNA 或RNA ），尽管核酸纯度
仍有提升空间，但该方法为对于相对欠发达地区基层检疫防疫
部门的核酸检测提供了一种经济高效的便捷方法，随着方法优
化改进具有广阔的应用前景。
5结论
本研究滤纸片方法利用简易的纸基层析原理进行试剂配
方的优化，可以从200μL 样本中快速捕获微量病毒核酸，操作流程十分简便，10min 内即可完成病毒核酸的提取纯化，为基层核酸分子检测提供了一种经济高效的实用方法。█
参考文献：
[1]高源，申辛欣，冯志山，等.简化核酸提取过程在病原体核酸检测中的应用
现状和发展趋势[J].病毒学报,2021,37(2):445-450.
[2]高慎阳，李丹丹，查恩辉，等.一种纸基层析法病毒核酸提取试剂盒:
CN112941068A[P].2021-06-11.
[3唐蕊华.空间站微生物纸基微流体核酸即时检测技术的研究[D].西北工
业大学,2017.
[4]刘莹，王珅，周铁忠，等.装载戊型肝炎病毒核酸片段的重组MS2噬菌体
衣壳的制备及其特性研究[J].病毒学报,2016,32(5):538-544.
[5]Jothikumar N,Cromeans TL,Robertson BH,et al.A broadly reactive
one-step real-time RT-PCR assay for rapid and sensitive detection of hepatitis E virus[J].J Virol Methods,2006,131(1):65-71.
表1 RT-qPCR 的引物和探针序列
95 ℃ 5min 95 ℃ 10s 30s
表2 RT-qPCR 反应体系和程序程序
40个循环图1本提取方法和对照组提取方法HEV 假病毒核酸样本的扩增曲线图
注：其中左侧三条曲线为本本提取方法扩增曲线；右侧三条曲线为对照组提取方法的扩
增曲线。
注：变异系数CV=（标准偏差SD/平均值Mean ）×100%；独立T 检验：P<0.01。
Ct 值（3个重复）平均值Ct 标准差SD 变异系数CV （%）Ct 值（3个重复）平均值Ct 标准差SD
变异系数
CV （%）14.2512.29
15.0311.54
14.53
11.84
3.20
表3 血清中HEV 假病毒核酸两种提取方法经RT-qPCR 扩增后Ct 值比较
本提取方法
14.600.39 2.6811.890.38对照组提取方法130
Copyright ©博看网. All Rights Reserved.
版权声明：本站内容均来自互联网，仅供演示用，请勿用于商业和其他非法用途。如果侵犯了您的权益请与我们联系QQ:729038198，我们将在24小时内删除。
发表评论