抗体药物Fc功能优化的概念化设计及应用
抗体药物Fc功能优化的概念化设计及应用
2019-11-05 08:49
摘要
抗体及抗体样Fc融合蛋白已近成功用于癌症，过继性免疫感染，成瘾，以及自身免疫性疾病。通常这些生物药用于阻断蛋白质之间的相互作用，涉及宿主受体与诱导信号的作用，重新招募效应细胞到靶细胞周围，以及固定补体系统蛋白等等。由于抗体在感染和遗传性疾病方面巨大的潜能，众多的研究致力于提高抗体效能和特异性功能方面。而抗原抗体之间的相互作用也显得尤为重要，其重要性不亚于抗体铰链区及重链恒定区在抗体发挥功能中的作用。抗体铰链区和恒定区通过结合宿主受体或补体蛋白介导效应功能及调节抗体的循环。分子水平及结构分析研究已经揭示了不同种属，不同亚类抗体铰链区和恒定区如何识别宿主受体及补体蛋白的作用机制。分子层面的详细解读使得人们可以通过干预铰链区及恒定区序列，糖基化修饰达到增强或降低抗体效应功能和改变抗体半衰期的目的。本文着重描述概念层面上对抗体铰链区，Fc区优化，并描述相应的优化介导的抗体生物学效应以及潜在的临床疾病应用价值。
背景
自1986年第一款单克隆抗体药物经FDA获准上市，抗体及抗体衍生物药物快速增长，截止2015年有44款抗体药物在美国和欧洲获准上市。与预期一致的是抗体药保持着每年新增6-9种的速度，目前已攀升多达70多种。预计在接下来的几年内全球基于抗体的药物销售额将达到600-750亿美元。因此，很多制药企业涉足抗体样分子并以此作为他们收入及当地税收的增长点。
基础科学持续致力于基因紊乱，癌症，感染性疾病的发病机制研究，发病机制的深入研究助力基于抗体的生物药抵消这些非正常生物进程中的作用，起到临床的效果。抗体如何抵消这些非正常生物学进程可以通过优化选择那些经过序列修饰的抗体分子进一步增强或者废除它们与宿主免疫系统的作用来达到。企业及科研实验室关于抗体修饰的概念论证是走向应用的基础。很多获准上市的抗体包括传统意义上经典的单克隆抗体以及经过优化的抗体像Orencia R (abatacept),Soliris (eculizumab), Nplate (romiplostim), 和Removab 都是已证实有效的优化抗体药物。
为了优化抗体功能，从业者需要对抗体的构造，以及组成元件的作用深入了解。一个完整的
抗体分子包含两条50KDa的重链和两条25KDa的轻链，组成150KDa的可溶性的免疫球蛋白。每条重链和轻链之间通过二硫键以及非共价键形成稳定的异二聚体，两个异二聚体之间通过重链之间的二硫键形成完整的抗体。每条重链和轻链形成的异二聚体包含抗原结合片段Fab,铰链区，Fc组成。铰链区又分为上，下，和核心区，Fc片段包含重链恒定区的CH2和CH3结构域。
抗体的恒定区也有助于抗体重链序列的变化。抗体重链可变区结合抗体重链恒定区构成完整的抗体重链。依据重链恒定区α，μ，γ，ε，δ的不同，结合可变区抗体分为不同的类型。在人类中，依据γ基因片段的不同又分为IgG1,IgG2,IgG3,IgG4 4个亚类，而它们的相似程度高达90%。临床上，每个亚类专职清除着不同病原体。例如，IgG2缺陷与荚膜病菌感染有关。其分子机制可能是个体缺乏IgG2类抗体对致病菌多糖的清除减弱。抗体Fc的工程化，对不同类型，不同亚型的抗体优化非常重要，其原因在于序列的变化决定了抗体与受体FcRn,FcαR,FcγR,以及补体蛋白C1q的亲和力和特异性。其中FcγRs中有5类通过结合IgG来激活效应细胞,这些激活受体型包括FcγRⅠ,FcγRⅡa,FcγRⅡc,FcγRⅢa,FcγR,Ⅲb5类激活性受体,和1类抑制型FcγR——FcγRⅡb。FcγRs具有多态性，某些等位基因对于Fc有高度亲和力，例如FcγRⅢa中V158与F158相比对IgG1 Fc有更高的亲和力。抗体结合与这些受体可以
有效募集效应细胞靶向靶细胞或者病原体并对其清除（图1A）。因此，对于Fc以及铰链区序列突变和翻译后修饰的改变赋予抗体及其抗体样蛋白在效应功能及体内循环半衰期上的改变。除了序列突变，Fc区含有一个297位N-连接的糖基化位点，这对抗体结构和功能都很重要。大多数已获准的临床抗体药为IgG,其亚型多数为IgG1,目前有3款IgG2类型的抗体药在美国上市，IgG3含有较长的铰链区容易被蛋白酶切割，以及相对于其它亚型较短的半衰期。由于这些原因IgG3类抗体还未作为型抗体的亚型。由于绝大多数临床获准抗体药物为IgG类，优化IgG与FcγR的结合主要集中在Fc的工程化优化上。然而，其他类型抗体如IgA,IgM,IgE类抗体由于也具有跟Fc受体的相互作用，所以值得关注，文章后面会介绍到在Fc工程化中的应用。
本文主介绍对于Fc与其作用蛋白之间相互作用的优化或者减弱的一些方法的应用。文章集中介绍Fc序列改变，糖基化改变，从而达到改变Fc引起的效应功能，Fc的优化主要集中在单点突变引起的加强或者消除Fc与受体的结合，或者二者兼有，通过本文的学习，获取一些关于Fc选择及改造的相关知识。
图1.基于抗体的药物应用
抗体Fc突变引起的效应功能增强
及的结构增强FcγR的结合
与FcγR的结合，是抗体行驶其效应功能所必需的，例如抗体依赖的细胞毒性（ADCC）,抗体依赖的细胞吞噬（ADCP），以下描述的是Fc优化影响与FcγR结合引起的ADCC与ADCP的增强。
点突变增强与FcγR的结合
已经有多种方法尝试优化抗体的Fc来增加它与相应的FcγR的结合（表1和图2）。Shields et
al 等人通过丙氨酸扫描确定Fc暴露氨基酸残留的相应位点，其指导原则为IgG1 Fc结构改变不超过3.2Å。Fc丙氨酸突变的筛选主要依靠与FcγRⅠ,FcγRⅡa,FcγRⅡb,FcγRⅢa和FcRn的结合，这些点突变可以划分为增强或者减弱与FcγR和FcRn结合两类。27个独特突变显著增加了FcγR和FcRn中1类受体的增强结合。为了试图工程化Fc达到与介导ADCC效应的FcγRⅢa的强结合，丙氨酸扫描突变结合了不止一个突变位点。一个组合突变Ser298Ala, Glu333Ala,和 Lys334Ala ，也称作AAA突变，可以显著增强IgG1与FcγRⅢa的结合（表1），与FcγRⅢa结合的增强使得拥有AAA突变的Herceptin 在体外杀伤Her2+细胞的杀伤效果提升了50-100倍。
在一个直接的评估方法中，Lazar et al等人用计算机辅助测算氨基酸替代对于Fc与FcγRⅢa相互作用的提高。他们也得出了一系列高质量的突变显著提高抗体的稳定性和可溶性，与野生型Fc相比，Ser239Asp 和Ile332Glu 单点突变可以将Fc与FcγRⅢa的结合提高1个数量级（如图2A），为了Fc与FcγRⅢa的结合最大化，将Ser239Asp 和Ile332Glu 两个单点突变结合，双点突变将Fc与FcγRⅢa的结合提高2个数量级（如图2A）。然而，Ser239Asp 和Ile332Glu 双突变也增加了与抑制性受体FcγRⅡb的结合。这一不太令人满意的负面效应可以通过增加Ala330Leu 突变形成Ser239Asp/Ile332Glu/Ala330Leu 突变部分的抵消掉。Ser239
Asp/Ile332Glu/Ala330Leu通常称作DLE突变已经被引入抗癌药物Trastuzumab 的Fc中。与野生型Trastuzumab相比，引入DLE突变的抗体药引起的ADCC效应杀伤HER2+的癌细胞，无论在低表达还是高表达HER2+癌细胞,其杀伤效果都提高了2个数量级。DLE突变也增强了整合素抗体体药物MEDI-522 ADCC作用,针对黑素瘤的杀伤效果显著提高。类似的，该突变还增强了针对CD20抗体药物Rituximab的ADCP抗肿瘤作用。
表1.Fc修饰增强抗体效应功能
在细胞水平上，DLE突变抗体相对于野生型抗体可以招募更多的NK细胞到抗体包裹的靶细胞周围。接近90%的招募NK细胞参与到除此相互作用的靶细胞杀伤中，随后移动到其他可以相互作用的靶细胞周围参与杀伤。因此，随着时间的推移，单个NK细胞可以杀伤众多的相互作用靶细胞杀。这种DLE优化的抗体逐渐增加招募NK细胞有效杀伤靶细胞的作用机制归因于增加了FcγRⅢ介导的信号，主要体现在ZAP70的磷酸化，以及引起的下游信号转导。
包含Ser239Asp/Ile332Glu/Ala330Leu (DLE突变)的Fc晶体结构解释了突变引起的Fc对FcγRⅢa结合的影响。结构显示突变的Fc在构象上呈开放状态，与野生型Fc相比，突变的Fc两个CH2结构域之间的距离增加了30 Å。热稳定性测定显示打开状态的CH2结构域使得CH2结构域稳定性降低，DLE突变使CH2结构更加灵活。优化的Fc与FcγRⅢa相互作用模型用来筛选评价DLE突变能否增加Fc与FcγRⅢa相互作用。的确，从结构上显示，Ser239Asp/Ile332Glu突变增加了Fc与FcγRⅢa上Lys158形成额外的氢键，Ala330Leu突变增加了Fc与FcγRⅢa上Ile85的氢键。另外，结构模型也显示二者之间的静电作用以及疏水作用力都有所增加。
Mimoto et al.等人设计了非对称的Fc优化结构结合DLE突变形成了新的Fc优化结构，在大量
的突变筛选中，他们加测了1000多个Fc单点突变,结果显示那些增加了与FcγRⅢa结合的突变，仅仅需要突变IgG重链就可以实现。他们从整合进重链恒定区突变库中选择出了3个点突变Leu234Tyr, Gly236Trp, 和 Ser298Ala（称作YWA突变）。鉴于DLE已经被证实显著增加Fc与FcγRⅢa的结合，他们将筛选到的突变整合进另一条抗体重链的恒定区。因此，抗体一条重链的恒定区包含YWA突变，另一条重链恒定区整合进了DLE突变。体外ADCC实验显示这样非对称组合显著强于对称的YWA突变和DLE突变结构。因此，这样的Fc非对称结构设计使得人们可以将多个优化突变整合进两条重链以增强Fc功能。

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