山东省生猪屠宰企业非洲猪瘟病毒核酸检测能力比对
山东省生猪屠宰企业
非洲猪瘟病毒核酸检测能力比对
孙圣福1，陈　伟2，徐　鸿1，徐　聪1，蔺晓月1，
邢林林1，李玉杰1，兰邹然1，田夫林1
（1. 山东省动物疫病预防与控制中心，山东济南　250100；
2. 济南市动物疫病预防与控制中心，山东济南　250100）
摘　要：为客观评价生猪屠宰企业非洲猪瘟检测能力，山东省动物疫病预防与控制中心组织全省319家生猪屠宰企业开展非洲猪瘟病毒核酸检测能力比对。结果显示：有314家屠宰企业反馈结果，其中有225家检测结果完全合格，合格率为71.66%，样品正确率为88.47%（1389/1570）；A类和B类屠宰企业合格率分别为79.14%和60.63%。结果表明，山东省生猪屠宰企业非洲猪瘟病毒检测能力有待进一步提升。结果提示，畜牧兽医主管部门应强化屠宰企业监管，加强对屠宰企业技术人员的培训和实验室管理的指导。
关键词：生猪屠宰企业；非洲猪瘟；检测能力比对；山东省
中图分类号：S851  文献标识码：C  文章编号：1005-944X（2021）04-0076-04
DOI：10.3969/j.issn.1005-944X.2021.04.015
Comparison of Testing Capacity for ASFV Nucleic Acids in
Pig Slaughtering Enterprises in Shandong Province
Sun Shengfu1，Chen Wei2，Xu Hong1，Xu Cong1，Lin Xiaoyue1，
Xing Linlin1，Li Yujie1，Lan Zouran1，Tian Fulin1
（1. Shandong Center for Animal Disease Prevention and Control，Jinan，Shandong　250100，China；
2. Jinan Center for Animal Disease Prevention and Control，Jinan，Shandong　250100，China）Abstract：In order to objectively evaluate the testing capacity for African swine fever virus（ASFV）in pig slaughtering enterprises in Shandong，319 enterprises were organized to compare their testing capacity for ASFV by Shandong Center for Animal Disease Prevention and Control. The results showed that 225 out of 314 enterprises who submitted their feedback were fully qualified with a qualifie
d rate of 71.66% and the accuracy rate of samples was 88.47%（1389/1570）；the qualified rates of class A and B enterprises were 79.14% and 60.63%，respectively. It was concluded that the testing capacity should be improved in such enterprises who should be further supervised，and technicians should be provided with training and guided for laboratory management by veterinary authorities.
Key words：pig slaughtering enterprise；ASF；comparison of testing capacity；Shandong Province
收稿日期：2020-11-06　修回日期：2020-12-10
基金项目：国家重点研发计划项目（2018YFD0500800）；山东省重大科技创新工程项目（2020CXGC010801）同等贡献作者：孙圣福，陈　伟
通信作者：田夫林。E-mail：fulin_tian@163
兰邹然。E-mail：lanzrjn@163
2021年第38卷第4期
非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的一种猪的高度接触性传染病，临床表现为高热、网状内皮系统出血。其病死率高达100%，严重威胁着养猪业的发展。世界动物卫生组织（OIE）将其列为须通报动物疫病，
我国将其列为一类动物疫病。2018年8月，王清华等[1]首次报道了我国首例非洲猪瘟的确诊。2019年4月，农业农村部规定生猪屠宰企业要按照“批批检、全覆盖”的原则开展非洲猪瘟检测[2]。实验室检测能力比对是评价和提高实验室检测能力和管理水平的重要手段[3-4]。按照农业农村部要求，2020年3月，山东省动物疫病预防与控制中心组织全省319家生猪屠宰企业开展非洲猪瘟病毒核酸检测能力比对工作。本次检测能力比对，客观反映了生猪屠宰企业非洲猪瘟病毒检测能力，也发现了其中存在的问题，对山东省以及其他省份非洲猪瘟防控起到积极作用。
1　材料与方法
1.1　比对项目、方法
比对项目为非洲猪瘟病毒核酸检测，检测方法采用荧光定量聚合酶链式反应（Q-PCR），具体操作按照相应检测试剂盒说明书进行。
1.2　参与企业
山东省319家生猪屠宰企业全部参与本次非洲猪瘟病毒核酸检测能力比对。
1.3　样品和试剂
样品为包含非洲猪瘟病毒基因组的液体样品，由青岛立见诊断技术发展中心提供并标定，由山东省动物疫病预防与控制中心致盲后重新分组编号。
1 595份样品分为319组，每组5份样品，包含强阳性、弱阳性和阴性3个滴度各1份，其余2份样品从样品库中随机抽取。样品由参加检测能力比对的屠宰企业自行领取，并于1
2 h内送至各自实验室，收到样品48 h内反馈结果。
检测试剂由各参加比对的屠宰企业自行在农业农村部批准的或经中国动物疫病预防控制中心评价后公布的诊断试剂目录中购买。1.4　结果判定
屠宰企业盲样检测结果与参考值一致，判定为样品检测结果正确；5份样品结果完全一致，判定为该企业检测结果合格；1份或1份以上样品检测结果与参考值不一致，判定为该企业检测结果不合格。
假阳性即为将参考值为阴性的样品检测为阳性；假阴性即为将参考值为阳性的样品检测为阴性。
2　比对结果
2.1　总体情况
319个屠宰企业中，按时提交检测结果的有314个，结果反馈率为98.43%。反馈结果的企业中，有225个企业检测结果合格，合格率为71.66%（225/314）。1 570份样品中，有1 389份样品检测结果正确，样品正确率为88.47%。其中有1份样品检测结果错误的屠宰企业有43个，2~4份样品检测结果错误的有44个，2个屠宰企业检测结果完全错误。详见表1。
2.2　不同规模类型屠宰企业
314个生猪屠宰企业中，A类企业（屠宰产品可在全国范围内流通）187家、B类企业（屠宰产品仅限省内流通）127家，A类和B类屠宰企业合格率分别为79.14%和60.63%
。
类别数量/个占比/%
反馈结果的屠宰企业总数314100全部正确屠宰企业22571.66
1份样品错误的屠宰企业  4313.69
2~4份样品错误的屠宰企业  4414.01
完全错误的屠宰企业    2
0.64
生猪屠宰企业类型总数/个合格数/个合格率/% A类18714879.14
B类127  7760.63
合计/平均31422571.66
2.3　检测结果错误的屠宰企业情况
出现结果错误的89个屠宰企业中，有9个（10.11%）出现假阳性，74个（83.15%）出现假阴性，6个（6.74%）既有假阳性又有假阴性（表3）。
3　分析与讨论3.1　比对总体情况
参加非洲猪瘟病毒核酸检测能力比对的屠宰企业有319家，除了5家没有按照规定反馈结果外，其余314家均及时反馈了检测结果。其中225家为合格，占71.66%，尚有89家屠宰企业检测结果出现错误。针对这种情况，山东省畜牧兽医局及各市县畜牧兽医主管部门已经责令89家检测结果不合格的和5家未反馈结果的屠宰企业进行停产整顿，并展开现场调查和督导，限定时间内达不到检测要求的取缔其生猪屠宰资格。3.2　不同类型屠宰企业情况
从结果看，A 类企业检测结果好于B 类企业，这也与辽宁省的情况一致[4]。究其原因：A 类屠宰企业屠宰量大，屠宰流程更规范，对非洲猪瘟检测重视程度较B 类企业高；其产品在全国流通，一旦出现问题将会影响其在全国的销售，因此更加重视产品质量。B 类企业屠宰量小，产品仅在省内流通，部分小型屠宰企业产品仅在市县范围内流通，囿于成本考虑，对非洲猪瘟检测设施设备和人员的投入仅能满足最低要求；而且由于生猪出栏数量降低和生猪价格上涨，一些B 类屠宰企业难以生存，也很难增加非洲猪瘟检测投入。3.3　出现假阴性原因
检测结果出现错误的企业中，存在假阴性结果的企业有74个，占出现错误结果屠宰企业的83.15%。假阴性即为将真实结果为阳性的样品检
测为阴性。经调查分析有以下几种原因：一是屠宰企业自身不重视非洲猪瘟检测，没有投入足够的资金、人员，实验室设施设备不完善；二是从事检测的人员不具备检测能力，没有完全掌握仪器设备的基
本操作，试验操作不规范，对于检测结果也缺乏应有的专业知识和经验，不会判定阴、阳性结果；三是实验室设施设备不达标，缺乏检测必备的仪器设备，多采用免核酸提取的方法进行检测，采用的荧光定量PCR 仪多为国产仪器，灵敏度不够；四是试剂运输和保存不规范，荧光定量PCR 试剂应在低温环境下运输，在-15 ℃以下冷冻保存，而某些屠宰企业未按照试剂所需温度、条件运输和保存，造成试剂敏感性下降；五是实验室布局不合理，没有独立封闭区域，部分屠宰企业从生活区随意选取房间开展检测，与检测无关的人员自由出入，导致检测环境不够洁净；六是检测采用的耗材质量不过关，试验所用的eppendorf 管、Tip 头等洁净度不够，造成核酸降解，选用的PCR 管透明度不够，无法吸收PCR 扩增产生的光学信号。3.4　出现假阳性原因
检测结果出现错误的企业中，存在假阳性结果的企业有9个，占出现错误结果屠宰企业的10.11%。假阳性即为将真实结果为阴性的样品检测为阳性。经调查分析有以下几种原因：一是实验室布局不合理，配液区、样品处理区、核酸提取区和扩增检测区之间没有物理隔断，没有单向顺序，仪器耗材没有单向流动，扩增过程中产生的核酸累积造成污染；二是实验室硬件不达标，缺少样品处理、核酸提取等需要的生物安全柜，所有操作都在开放环境中进行，造成了环境污染；三是操作不规范，操作过程中阳性对照没有离心直接开盖，产生气溶胶造成污染，加样过程中移液器使用不当造成污染等；四是不消毒或者消毒不彻底，试验结束后，未对实验台面、仪器设备进行清洁消毒，或者消毒不规范，从下游区域向上游区域消毒，且采用同样的
抹布擦拭，导致扩增产生的核酸通过抹布带到上游
类别
数量/个
占比/%假阳性屠宰企业910.11假阴性屠宰企业
7483.15既有假阳性又有假阴性屠宰企业
6
6.74
2021年第38卷第4期
区域，对下一次检测造成污染。
4　建议和对策
4.1　加强对非洲猪瘟检测的重视
生猪屠宰环节开展非洲猪瘟检测对于非洲猪瘟防控有重要意义。一旦携带非洲猪瘟病毒的生猪进入屠宰环节而没有被及时发现，就会造成整个屠宰场污染。屠宰企业与养殖场之间存在人员、车辆、工具等的频繁接触，存在病毒汇集、扩散的风险[5]。因此，屠宰企业应当加强对非洲猪瘟检测的投入，如投入足够资金建设科学规范的实验室，聘请具备相应检测能力的专业技术人员，购置精密的仪器设备，选用合格的检测试剂和耗材等。
4.2　加强对技术人员的培训
非洲猪瘟病毒核酸检测是一项专业性较强的技术工作，需要专业的技术人员开展，人员的技术水平和规范操作与检测结果的正确性成正比。从调查结果来看，屠宰企业检测人员整体专业化程度不高，大多未从事过实验室检测等专业技术操作，未培训上岗的人员占据一定比例。针对这种现象，山东省畜牧兽医局要求各级动物疫病预防控制机构对屠宰企业检测技术人员开展专业操作技术培训，培训合格后方可上岗。
4.3　加强对实验室基础设施的建设
实验室布局不合格，硬件设备不达标，是导致检测结果出现错误的重要影响因素之一。针对这种现象，山东省畜牧兽医局起草了屠宰企业非洲猪瘟检测实验室管理制度，内容包含实验室位置、布局、仪器设备、人员要求、实验室管理、检测工作要求等要素，指导屠宰企业开展非洲猪瘟病毒核酸检测工作。
4.4　加强对屠宰企业的监管
畜牧兽医主管部门应加强屠宰企业监管，定期对其产品或留存的样品进行抽检，以便能及时发现存在的问题，促进屠宰企业进行整改，同时引起屠宰企业的重视，避免其产生侥幸心理。
参考文献：
[1] 王清华，任炜杰，包静月，等. 我国首例非洲猪瘟的
确诊[J]. 中国动物检疫，2018，35（9）：1-4. [2] 农业农村部畜牧兽医局. 关于开展落实生猪屠宰环节
非洲猪瘟自检和官方兽医派驻制度百日行动的通知：农明字〔2019〕第20号[Z]. 北京：农业农村部，2019-04-25.
[3] 董昕欣，刘伟，邴国霞，等. 2014年全国省级兽医系
哪些省份需要核酸检测统实验室检测能力比对结果分析[J]. 中国兽医杂志，2014，50（10）：101-103.
[4] 兰德松，崔基贤，周维，等. 2019年辽宁省生猪屠宰
企业非洲猪瘟病毒检测能力比对[J]. 中国动物检疫，2020，37（4）：47-50.
[5] 何世成，王昌建，林源，等. 湖南省部分屠宰场非洲
猪瘟监测[J]. 中国动物检疫，2019，36（6）：6-8.
（责任编辑：高向向）

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