消化道酶活力
第四章 牛蛙主要消化酶的分布及pH和温度
  对消化酶活力的影响
牛蛙(Rana catesbeinana)隶属两栖纲无尾目蛙科，其肉质细嫩，味道鲜美，营养丰富，是有名的肉用型蛙类。牛蛙具繁殖快、适应性强、生长迅速和抗逆性强等优点，且其养殖饲料易取。在我国，牛蛙的人工养殖得到了大规模推广[1]。
研究消化酶的活力及其影响因素可了解动物对食物不同成分的消化能力，为动物天然饲料的选择、优质人工饲料的配制和适宜养殖条件的确立提供理论基础，对提高动物养殖的经济效益无疑是有帮助的。目前，对低等脊椎动物消化酶的研究主要集中在经济养殖型鱼类[2-9]和爬行类[10]，对两栖类消化酶的研究报道较少[11-14]。奚刚等[14]对牛蛙幼体发育阶段消化道蛋白酶和淀粉酶的活力变化情况进行了研究。有关成体牛蛙消化系统消化酶分布情况及各种理化因子对牛蛙消化酶活力的影响方面的研究尚未见报道。pH和温度是影响牛蛙生活的重要环境因子，其可通过影响消化酶活力直接影响牛蛙对食物的消化吸收能力，并最终影响牛蛙的生长发育。本文在检测牛蛙消化系统蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶分布情况的基础上，对pH和温度对牛蛙消化酶活力的影响进行了研究，旨在增进对牛蛙消化生理特点的认识，为牛蛙人
工养殖中环境因子的控制和饲料营养成分的合理搭配提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料 
鲜活的成体牛蛙购自芜湖市黄山西路菜市场，重250~300 g。将牛蛙毁髓处死，剖腹，迅速取出胰脏和完整消化道。将消化道剪开，用4℃ 预冷的0.65 %的生理盐水快速洗净，按食道、胃、前肠、中肠和后肠(直肠)取材，用吸水纸轻轻吸干，称重。
1.2 酶液的制备
根据所称得的消化系统各部分的质量，加入20倍质量的4 ℃蒸馏水，在冰水浴中充分匀浆，捣成糜状，以2000 r/min的速度冷冻离心15 min，取上清液即为酶液。保存于4℃冰箱中，8 h内分析完毕。
1.3 消化酶活力的测定
1.3.1 蛋白酶活力的测定 采用福林-酚试剂法[11]，略有改动。取0.5 mL 1 %的酪蛋白溶液于
试管中，分别加入不同pH值的缓冲液2 mL，混匀，30 ℃水浴预热5 min。在反应管中按食道、胃、前肠、中肠、后肠和胰脏顺序分别加入0.25 mL、0.25 mL、0.5 mL、0.5 mL、0.5 mL和0.5 mL预热的粗酶液。恒温水浴锅控制反应温度，充分反应15 min。立即加入1.5 mL 10 %的三终止反应，静置15 min。对照管在加入10 %三后再加酶液。过滤，取滤液1 mL，加0.55 mol/L的Na2CO3  5 mL，福林-酚试剂1 mL，摇匀。在30 ℃水浴中显15 min。用7200型分光光度计，680 nm 波长条件下测光吸收值。以30 ℃下每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸作为1个酶活力单位(U)。
1.3.2 脂肪酶活力的测定 采用聚乙烯醇橄榄油乳化液水解法[4]。取缓冲液2.5 mL和聚乙烯醇橄榄油乳化液2 mL于锥形瓶中，30 ℃保温5 min，然后在锥形瓶中加入1.0 mL酶液，30 ℃下反应30 min后立即加入95 ％乙醇5.0 mL终止反应，再加3滴酚酞，用0.05 mol/L氢氧化钠滴定，对照组在加入95 ％乙醇后再加酶液，其余与实验组相同。以30 ℃下每分钟作用于聚乙烯醇橄榄油乳化液产生的脂肪酸最后消耗1 mL 0.05 mol/L的NaOH为1个酶活力单位（U）。
1.3.3 淀粉酶活力的测定 采用3,5-二硝基水杨酸比法[4] ，略有改动。取0.665 mL预测粗酶
液于各试管，再分别加入相应pH值的缓冲液0.665 mL，混匀，将反应组置于30 ℃恒温水浴锅中预热5~10 min，同时对照组在100 ℃沸水中煮5~10 min（使酶失活）。再向反应组和对照组试管中加入已预热的1 %的淀粉溶液0.67 mL，摇匀，于30 ℃水浴反应20 min后再加入2 mL的3,5-二硝基水杨酸，摇匀。立即放入100 ℃沸水中显5 min，使酶失活并终止反应，流水冷却后稀释10倍，用7200型分光光度计，490 nm波长条件下比，测光吸收值。以30 ℃下每分钟水解淀粉产生1 mg麦芽糖作为一个酶活力单位（U）。
1.3.4 纤维素酶活力测定 采用羧甲基纤维素钠水解法[4]。取1.0 mL酶液于各试管，再分别加入相应pH值的缓冲液3.0 mL，0.5 %羧甲基纤维素钠溶液0.8 mL，蒸馏水0.6 mL，混匀40 ℃水浴糖化30 min，取出立即置于沸水浴15 min，对照组先置于沸水浴中使酶失活，其余步骤相同。取0.5 mL糖化液加3,5-二硝基水杨酸1.5 mL，沸水浴15 min，冷却，加蒸馏水3 mL，用7200型分光光度计，于550 nm处测吸光值。以40 ℃每分钟催化纤维素生成1.0 μg葡萄糖为一个酶活力单位（U）。
1.4 pH梯度的设置
利用不同pH值的缓冲液来调节反应的pH条件。实验中共使用4种缓冲液，以KCl-HCl配制pH
0.5-1.5的缓冲液，以Na2HPO4 -柠檬酸配制pH 2.2-8.0的缓冲液，以钠-盐酸配制pH 8.0-~9.6的缓冲液，以甘氨酸-氢氧化钠配制pH 10.0-10.6的缓冲液。胃消化酶的pH值范围为1.0、1.5、2.2、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0，共9个pH值梯度。肠和胰脏消化酶的pH值范围为4.0、5.0、6.0、7.0、7.4、8.0、9.0、9.6和10.0，共9个pH值梯度。
1.5 温度梯度的设置
设置15 ℃、20℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃和60 ℃共10个温度梯度，根据上面所测胃、肠和胰脏各自的最适pH值，选择对应的缓冲液按上述方法分别测定胃、肠和胰脏在不同温度条件下的消化酶活力。
1.6 数据处理
实验数据取3次测量的平均值（±SD），用单因素方差分析(one-way ANOVA)对不同部位消化酶的活力进行差异显著性比较，P<0.05为差异显著。
2 结果
2.1 牛蛙消化酶的分布
牛蛙消化系统不同部位蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活力见表1。由表4-1可知，牛蛙消化系统三种消化酶的活力均以胰脏最高，显著高于其它部位（P<0.05）。在消化道中，蛋白酶活力以胃最高，显著高于食道和肠道（P<0.05）。肠道各段间、肠道各段和食道间蛋白酶活力差异不显著（P>0.05）。脂肪酶活力在消化道各段由前至后逐渐增加，肠道脂肪酶活力显著高于胃和食道（P<0.05），其中后肠脂肪酶活力显著高于前肠和中肠（P<0.05），胃和食道间脂肪酶活力大小差异不显著（P>0.05）。淀粉酶活力主要分布于肠道，肠道各段淀粉酶活力显著高于胃和食道（P<0.05），肠道各段间淀粉酶活力差异不显著（P>0.05）。食道和胃淀粉酶活力大小相当，差异不显著（P>0.05）。我们还对牛蛙消化道纤维素酶的活力进行了检测，结果未观察到明显的酶活力。
表4-1  牛蛙消化酶分布
n=3; ±SD; Unit: U/g
食道
esophagus
胃
stomach
前肠
foregut
中肠
midgut
后肠
牛蛙养殖hindgut
胰脏
pancreas
蛋白酶活力
Activity of protease
14.5b±2.5
116.6a±17.3
7.98b±4.7
24.7b±8.0
3.63b±1.6
118.6a±24.3
脂肪酶活力
Activity of lipase
0.14d±0.01
0.18d±0.02
0.27c±0.02
0.29c±0.05
0.36b±0.07
3.67a±0.10
淀粉酶活力
Activity of amylase
0.14c±0.01
0.17c±0.02
1.02b±0.09
1.12b±0.08
1.05b±0.04
3.34a±0.05
注：上标不同的平均值间差异显著，a > b > c > d（P < 0.05）
2.2 pH对消化酶活力的影响
2.2.1 pH对蛋白酶活力的影响  不同pH值条件下，牛蛙胃、肠道和胰脏蛋白酶的活力变化情况见图1。由图4-1可知，三个部位蛋白酶活力与pH关系均呈单峰型，最适pH值分别为2.2、7.4和9.6。胃蛋白酶在pH值1.5-2.2范围内显示较强的活力，pH值为2.2时最高，pH值大于2.2后胃蛋白酶的活力急剧下降，pH值为6.0时酶活力只有最大活力的5.0 %左右。肠蛋白酶活力在pH值4.0-6.0范围内变化较平缓，在pH值6.0-7.4范围内随pH值的升高而快速升高，在pH值7.4时达到最大值，pH值继续增大时酶活力逐步下降。胰蛋白酶活力在pH值大于4.0时迅速增加，pH值为9.6时达最大值，pH值为10.0时胰蛋白酶活力又迅速下降。
图4-1  pH对蛋白酶活力的影响
2.2.2 pH对脂肪酶活力的影响  不同pH值条件下，牛蛙胃、肠道和胰脏脂肪酶的活力变化情况见图4-2。由图4-2可知，胃、肠道和胰脏脂肪酶活力与pH关系曲线均呈单峰型，最适pH值分别为2.2、7.4和8.0。胃脂肪酶活力在pH值1.5-2.2范围内上升较快，pH值为2.2时达最大值，pH值大于3.0后胃脂肪酶的活力又不断下降，pH值为7.4时酶活力只有最大活力的17.0 %左右。肠道脂肪酶活力在pH值为5.0-7.4范围内迅速上升，在pH值为7.4时达到最大值，而后又迅速下降；胰脂肪酶活力在pH值小于7.0时变化较平缓，pH值大于7.0时急剧上升，pH值为8.0时酶活力达最大值，而后迅速下降。

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