离体条件下植物器官的发生
离体条件下植物器官的发生
一、脱分化和再分化
（一）脱分化
脱分化也称去分化，是指离体培养条件下生长的细胞、组织或器官经过细胞分裂或不分裂逐渐失去原来的结构和功能而恢复分生状态，形成无组织结构的细胞团或愈伤组织或成为未分化细胞特性的细胞的过程。大多数离体培养物的细胞脱分化需经过细胞分裂形成细胞团或愈伤组织；但也有一些离体培养物的细胞不需经细胞分裂，而只是本身细胞恢复分生状态，即可再分化。其实，细胞脱分化并非离体培养所特有，而是植物界常见的现象，如秋季落叶是其叶柄基部已分化的薄壁细胞恢复分生能力，形成离层细胞；根的中柱鞘已分化的薄壁细胞恢复分生能力，增生的细胞向外突起，形成根原基。自然情况下，植物任何正在生长的部位如果受到虫伤、病伤、机械伤等，局部的细胞因受到创伤刺激，则内源生长素进行调控而启动脱分化，恢复分生能力，形成愈伤组织，对受伤组织起保护作用。
离体培养的外植体细胞要实现其全能性，首先要经历脱分化过程使其恢复分生状态，然后进行
再分化。脱分化是分化的逆过程。与细胞分化一样，脱分化的机理尚未得到清楚阐明，但人们已经积累了诱导脱分化期间的细胞学以及生理生化方面的一些资料，如膜透性的改变，细胞核的增大，内质网范围扩大，多核糖体形成，气体交换率增加，不同基因活化引起的生长激素的分解或合成，过氧化物酶增加，蛋白质和酚类物质合成活跃、乙烯产物增加等。这些变化改变了细胞原有的生理状态，引起细胞分裂。
（二）再分化
离体培养的植物细胞和组织可以由脱分化状态重新进行分化，形成另一种或几种类型的细胞、组织、器官，甚至形成完整植株，这个过程（现象）称为再分化。
1.细胞水平的再分化
再分化中首先可见的是细胞壁变厚、假导管细胞的形成及酶水平的变化和明显的机能分化，从而形成各种类型的细胞。
2.组织水平的分化
当愈伤组织在高水平生长素条件下，最常见的是维管组织的分化。松散的愈伤组织内含有大量拟分生组织或瘤状结构。致密的愈伤组织内组织分化很少，大多由高度液泡化的细胞组成。
3.器官水平的再分化
又称为器官发生。再分化的组织可形成各种器官，如根、茎或芽、叶、花以及多种变态的器官（如鳞茎、球茎、块茎等）。根据起源不同，器官发生可分为器官型和器官发生型。前者直接由外植体的细胞形成器官原基，继而发育成器官；后者由外植体先形成愈伤组织，再由愈伤组织产生不同的器官原基。在有些情况下，器官是由切下的外植体中已存在的器官原基发育而成的，但大多数是经分化重新形成的。离体培养下的器官原基的形成过程是：外植体脱分化（可能形成愈伤组织）后形成一些分生细胞团，随后由之分化成不同的器官原基。从解剖学角度来看，这些分生细胞团通常是由一个或一小团分化细胞分裂而形成的的，其细胞内充满稠密的原生质，细胞核显著增大。这些分生细胞团形成一段时间后，在器官纵轴上出现单向性，进一步形成器官原基。需要指出的是，分生细胞团的出现并不一定导致器官发生，有时可能继续形成愈伤组织或分生成维管组织。
4.植株再生
根和茎（包括其变态器官）或芽器官的发生可使植株重建。在离体培养中通过根、茎发生而形成再生植株的方式大致有三种：
①芽产生后，芽的基部长根形成小植株；
②先形成根，根上再出芽；
③愈伤组织的不同部位分别形成芽和根，然后形成维管组织把两者结合起来形成一个植株。一般而言，离体培养中先形成芽后，其基部很容易形成根，而培养物如先形成根，则往往抑制芽的形成，所产生的根、芽一般为不定根、不定芽。一些具有变态茎、叶器官的植物，离体培养时易于形成相应的变态器官，如百合和水仙鳞茎切块培养中可见由分化的芽形成的小鳞茎。
离体培养中再生植株的主要途径是器官发生和胚胎发生，而原球茎发生、绿球状体发生、球状茎原基发生、外植体已存在的器官原基萌发等再生途径由于与器官发生有较密切联系，将之归入广义上的器官发生途径。原球茎发生是兰科等植物离体培养中特有的植株再生途径。
原球茎是兰花种子发芽过程中一种形态学构造。种子萌发初期并不出现胚根，只是胚逐渐膨大，以后种皮的一端破裂，肿胀的胚呈小圆锥状，故称为原球茎。因此，原球茎可理解为缩短的、呈珠粒状的、由胚生细胞组成的、类似嫩茎的器官。在兰科等植物的离体培养中，常从茎尖或侧芽甚至叶片的培养中产生这样的原球茎。从一个芽的周围能产生几个到几十个原球茎，培养一段时间后，原球茎逐渐转绿，长出毛状假根，叶原基发育成幼叶，转移至生根培养，即可形成完整再生植株。原球茎本身也可以不断增殖，只要在原球茎转绿之前将之切割成小块或给予针刺等损伤，再转移到新鲜的增殖培养基上，就可增殖出更多原球茎。GGB发生途径是蕨类植物离体培养中出现的。GGB是一种绿的球状体，结构与兰花的原球茎相似，可以增殖，并可在一定条件下诱导成苗。在蕨类植物的工厂化生产中，GGB发生途径比不定芽发生途径的生产效率高得多。茎原基增殖（MSP）途径在菊科等一些植物中诱导成功，它可能与GGB类似。腋生枝萌发是离体条件下促进腋芽或顶芽生长，并通过不断切割增殖而得到大量嫩茎，再转移到生根培养基长根后形成完整植株。这种方式也称“无菌短枝扦插”或“微型扦插”，由于不经愈伤组织而再生，极少发生变异，是最能使无性系后代保持原品种特性的一种繁殖方式。
二、影响细胞脱分化和再分化的因素
（一）影响细胞脱分化的因素
植物离体培养中，细胞脱分化与外植体本身以及环境条件有关，影响的因素主要有：
①损伤。外植体由于切割损伤的刺激，导致细胞内一系列生理生化的变化，促使细胞增殖，这可能是生命的一种自我调节机制。
②生长调节剂。主要是生长素类起作用，因而在诱导愈伤组织时常加入生长素类，但同时配合使用细胞分裂素则效果可能更好。黑暗组织
③光照。弱光或黑暗条件常有利于脱分化中的细胞分裂。
④细胞位置。外植体本身的各类细胞可能对培养条件的刺激有不同的敏感性。
⑤外植体的生理状态。不同生理年龄和不同季节都会有不同的培养反应。
⑥植物种类差异。不同种类的材料脱分化难易有所区别，一般情况下，双子叶植物比单子叶植物及裸子植物容易。
（二）影响细胞再分化的因素
从理论上讲，各种植物的活细胞都具有全能性，在离体培养条件下均可经过再分化形成各种类型的细胞 、组织、器官以及再生植株。但实际上，目前还不能让所有植物的所有活细胞都再生植株。
主要原因是：
①不同植物种类再分化的能力差异很大；
②对某些植物的植株再生条件还没有完全掌握。影响细胞再分化的因素与影响脱分化的因素基本一样。
三、愈伤组织培养
（一）愈伤组织形成、生长和保持
1.愈伤组织的形成
在脱分化过程中，大多数情况下形成愈伤组织。愈伤组织的细胞结构往往是异质性的，无明显极性，其形成过程可分为诱导期、分裂期和分化期。
（1）诱导期 
诱导期又称启动期，是愈伤组织形成的起点，是指细胞准备进行分裂的时期。当外植体上已分化的活细胞在外源激素和其他刺激因素的作用下，细胞的大小虽然变化不大，但其内部却发生了生理生化变化，如合成代谢加强、迅速进行蛋白质和核酸的合成。诱导期的长短因植物种类、外植体的生理状况和外部因素而异，如菊芋的诱导仅需1d，胡萝卜则要几天。
（2）分裂期 
此时，外植体的外层细胞出现了分裂，中间细胞常不分裂，故形成一个小芯。由于外层细胞迅速分裂使得这些细胞的体积缩小并逐渐恢复到分生组织状态，细胞进行脱分化。处于分裂期的愈伤组织的共同特征是：细胞分裂快，结构疏松，缺少有组织的结构，颜浅而透明。如果在原培养基上培养，细胞将不可避免的发生分化，产生新的结构，而将其及时转移到新鲜培养基上，愈伤组织可无限制地进行细胞分裂，维持其不分化的状态。

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