(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利说明书 | ||
(10)申请公布号 CN 102776152 A (43)申请公布日 2012.11.14 | ||
(21)申请号 CN201210213073.X
(22)申请日 2012.06.26
(71)申请人 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所;哈尔滨维科生物技术开发公司
地址 150001 黑龙江省哈尔滨市南岗区马端街427号
(72)发明人 吴东来 徐青元 刘霓红 杨涛
(74)专利代理机构 北京科龙寰宇知识产权代理有限责任公司
代理人 孙皓晨
(51)Int.CI
C12N5/20
C07K16/10
G01N33/577
C12R1/91
权利要求说明书 说明书 幅图 |
(54)发明名称
抗蓝舌病病毒VP7蛋白的单克隆抗体,分泌该抗体的杂交瘤细胞株及应用 | |
(57)摘要
本发明公开了一种抗蓝舌病病毒VP7蛋白的单克隆抗体，分泌该抗体的杂交瘤细胞株及应用。本发明以原核表达的BTV-VP7蛋白免疫BALB/c小鼠，分离免疫后小鼠的脾细胞，使其与SP2/0细胞进行融合，用原核表达的BTV-VP7蛋白检测分泌相应单克隆抗体的杂交瘤细胞，并采用有限稀释法对筛选到的杂交瘤细胞进行分离纯化，最终得到一株可以稳定分泌抗BTV-VP7蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并将其所分泌的单克隆抗体命名为BTV-4H7。IFA实验结果显示BTV-4H7可以与1～24型BTV发生特异性反应。利用该单克隆抗体建立的C-ELISA可以快速、准确的检出1～24型BTV感染动物阳性血清。 | |
| 法国和澳大利亚谁厉害 |
法律状态
法律状态公告日 | 法律状态信息 | 法律状态 |
权 利 要 求 说 明 书
1.一株分泌抗蓝舌病病毒VP7蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏在中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为:CGMCC No.5715。
2.一种由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。
3.权利要求1所述的杂交瘤细胞株在制备诊断或检测蓝舌病病毒感染动物试 剂中的应用。
4.权利要求2所述的单克隆抗体在制备诊断或检测蓝舌病病毒感染动物试剂 中的应用。
说 明 书
<p>技术领域
本发明涉及一株杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体，尤其涉及一株分泌抗蓝舌病病毒VP7蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其所分泌的单克隆抗体。本发明还涉及上述杂交瘤细胞株和单克隆抗体在制备诊断蓝舌病病毒感染动物试剂中的应用，属于蓝舌病的防治领域。
背景技术
蓝舌病（Bluetongue disease,BT）是由蓝舌病病毒（Bluetongue disease virus，BTV）引起的，通过吸血昆虫传播的反刍动物病毒性传染病,以口腔、鼻腔和胃肠道黏膜发生溃疡性炎症变化为特征。BTV为双股RNA病毒，其基因组包含10个节段，大小约为19kb。BTV为呼肠孤病毒科（Reoviridae）环状病毒属（Orbivirus）蓝舌病病毒亚（Bluetingue virus subgroup）的成员之一，环状病毒属共有14个亚，其中蓝舌病病毒亚与鹿出血症病毒亚有较强的交叉反应性。BT最早于1876年发现于南非的绵羊，由于发病绵羊持续高热，口腔出现溃疡损伤，口腔粘膜及舌头发蓝，因此，于1906年提议定名为“
蓝舌病”，牛的BT发现于1943年。BTV几乎可以感染所有的反刍动物，包括家养和野生的牛、山羊和某些野生动物。牛、山羊、鹿及羚羊等野生反刍动物可长期带毒，并在疾病流间歇期扮演着病毒宿主的角。而吸血昆虫，特别是库蠓是其主要传播媒介。1940年前本病仅限于撒哈拉以南的非洲大陆，到40年代已蔓延至中东一些国家和地区，例如：塞浦路斯、叙利亚、伊拉克、土耳其、以列和巴勒斯坦。1948年美国报道此病。70年代后期本病广泛分布于热带、亚热带国家。1956～1957年在欧洲尤其是西班牙和葡萄牙流行。1978在澳大利亚的库蠓体内分离到BTV。目前，热带和亚热带地区绝大多数国家的易感动物都可能感染BTV或与之密切相关的病毒。我国于1979年在云南师宗首先发现本病并分离出BTV，从而确定了本病在国内的存在，随后在湖北（1983）、安徽（1985）、四川（1988）、甘肃（1990）、山西（1991）等29个省均检出BTV血清学阳性牲畜。近年来，随着全球气候变暖，BT在许多 国家相继爆发，且分布范围不断扩大。2006年8月，德国、比利时、法国、荷兰等首次发现牛感染BT，2007年7月，英国、法国、意大利等国爆发本病。世界动物卫生组织（OIE）通报，2008年3月～4月，法国、意大利等国爆发了BT，2009年1月～12月，英国、法国、意大利、澳大利亚、希腊、以列、丹麦、捷克、瑞典、挪威、西班牙、德国、奥地利、葡萄牙、匈牙利、荷兰、阿曼、阿尔及利亚、摩洛哥和突尼斯等国先后爆发BT。
由于BTV有24个血清型，各个国家血清型分布不均一，到目前为止，并没有有效的疫苗来防治本病，所以，早期准确诊断，早期预防，是防止本病爆发的最有效方法。鉴于我国已在多数省份和地区检测到该病，加之国际贸易中本病存在的风险，故我国急需加强对该病的研究，做好可对其进行防控和检测的技术储备，特别是建立BT的实验室诊断方法尤为重要。
VP7是一种极端疏水的蛋白质，具有349个氨基酸，比较VP7蛋白的一级结构，发现各血清型BTV-VP7蛋白中94%以上的氨基酸保守，包括第255位的赖氨酸。氨基酸序列的保守决定了VP7是特异性抗原这一特征。目前已有实验证实了VP7蛋白存在绝对保守区域，更为重要的是，VP7是病毒核心颗粒上的主要暴露蛋白，至少有两个表位暴露于病毒表面，这些特性均表明VP7可以作为检测BT的理想靶抗原。
发明内容
本发明的目的之一是提供一株能够分泌抗蓝舌病病毒VP7蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
本发明的目的之二是提供一种可与24个血清型蓝舌病病毒（BTV）发生特异性反应，而与IBAV、CV、AKAV、BVDV、IBRV、BRV、RV、BEV和FMDV不发生反应的单克隆抗体；
本发明的目的之三是提供以上所述的杂交瘤细胞株及其分泌的抗体在制备诊断或检测蓝舌病病毒（BTV）感染动物试剂中的应用。
本发明是通过以下技术方案来实现的：
本发明采用TRIZOL法提取BTV-12型病毒总RNA，进而利用反转录技术克隆VP7基因cDNA，将该cDNA插入原核表达载体pMAL-c4X，利用pMAL-c4x原核表达载体通过TB1感受态细胞对BTV-VP7基因进行原核表达，本实验室所表达的重组VP7蛋白携带有麦芽糖结合蛋白（MBP）标签，利用pMAL融合蛋白表达与纯化试剂盒中提供的直链淀粉树脂柱，对融合表达的VP7蛋白进行纯化。将一部分 纯化后的可溶性BTV-VP7蛋白作为免疫原，免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合。另一部分纯化后的VP7蛋白作为检测用抗原，建立间接ELISA检测方法对阳性杂交瘤细胞进行筛选最终获得一株稳定分泌抗BTV-VP7蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为BTV-4H7，其分类命名为：分泌BTV-4H7单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCC No.5715，保藏日期为2012年1月16日。
版权声明：本站内容均来自互联网，仅供演示用，请勿用于商业和其他非法用途。如果侵犯了您的权益请与我们联系QQ:729038198，我们将在24小时内删除。
发表评论