重组人β-防御素3对多耐药细菌的抑菌活性分析
丁克元
徐爱晖
【摘要】目的研究重组人β-防御素3（rhBD-3）对临床多耐药菌株（铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌、金黄葡
萄球菌）的抗菌活性。方法
采用比浊法测定不同浓度rhBD-3下4种细菌液OD 值，确定最低抑菌浓度（MIC ）和最低杀菌浓度
（MBC ），并与对照组比较。结果rhBD-3对所测菌株菌均有抑菌活性，在一定的浓度范围内，
rhBD-3的浓度增高抑菌活性增强。rhBD-3的MIC 、MBC 与对照组比较有统计学差异（P ＜0.05）。结论
rhBD-3对临床多耐药细菌具有显著的抑菌活性，给解决临
床细菌耐药带来新希望。
【关键词】β-防御素3；抗菌活性；抗生素；多耐药菌株
Antimicrobial activity of recombinant human β-defensen 3against 4strains of Multi-drug resistant bacteria
DING Ke-yuan ，XU Ai-hui The Department of Respiratory Medicine ，The first Affiliated Hospital of Anhui Medical Univer-sity ，Hefei 230022，China
【Abstract 】Objective
To evaluate the antimicrobial activity of recombinant human beta defensin 3（rhBD-3）on multi-drug re-sistant bacteria （Pseudommonas aeruginosa ，Acinetobacter baumannii ，E nterobacter cloacae ，Staphylococcus aureus ）．Methods The
OD of 4strains fluid was measured by turbidity method ，minimal inhibitory concentration （MIC ）and minimal bactericidal concentration
（MBC ）was determined ，the differences were compared with those in the controls．Results rhBD-3demonstrates antimicrobial activity a-gainst all the strains．Within a certain concentration rang ，rhBD-3concentration increased ，antimicrobial activity enhanced．The MIC and
MBC of rhBD-3were significant difference with those in the controls．Conclusion
rhBD-3has significantly antimicrobial activity against
multi-drug resistant bacteria ，that brings new hope as effective substitute for multi-drug resistant bacteria．
【Key words 】β-defensin 3；Antimicrobial activity ；antibiotic ；Multi-
drug resistant bacteria doi ：10．3969/j．issn．1009－6663．2013．03．033作者单位：23001
安徽合肥，安徽医科大学第一附属医院呼吸科
通讯作者：徐爱晖，
E-mail ：xuaihui0909@163．com 感染性疾病曾一度威胁人类的生命健康。随着抗菌药物
的发现，微生物感染得到了有效控制。但是，由于第三代、第四代头孢菌素、氟喹诺酮类以及碳青霉烯类等抗菌药物在临
床广泛应用，革兰阳性菌中的MRSA 、VRE ，革兰阴性菌中的产ESBLs 、
AmpC 以及MDR 、PDR 菌株等随之出现并逐渐增多，细菌耐药性已经成为抗感染领域中的严峻问题
［1］
。
抗菌肽是存在于真核生物体内，参与免疫应答的小分子多肽，对细菌、真菌、寄生虫及包膜病毒有广泛的抗菌活性，更是被誉为“天然抗生素”，β-防御素3是抗菌肽的一种，因其在结构和功能上的特殊价值，成为新近研究的热点。本文通
过比浊法测定rhBD-3对临床呼吸道分离菌株铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌、金黄葡萄球菌的抑菌活性，并
分析rhBD-3抑菌活性，测定其MIC 值。材料与方法
一、材料：rhBD-3冻干粉购自美国R＆D 公司（批号4435-BD ），采用基因工程技术在大肠埃希菌中获得，分子量5.2
kDa ，纯度＞95%，－20ħ冷冻保存。实验所用菌株均从呼吸科住院病人的下呼吸道分泌物中培养、分离，并且经过Walk-Away96进行菌种鉴定。药敏实验采用OXOID 纸片扩散法（K-B 法），药物敏感性标准按美国国家临床实验室标准委员会（2000）判定结果，根据药敏实验结果选择临床多耐药菌
株，每种细菌选三株（用A 、B 、C 表示），排除耐药谱相同的菌
株。所有菌株均分装于EP 管细菌保存液中，－18ħ冷冻保存。M-H 培养基成分及LB 液体培养基成分购自英国OXOID 公司。
二、方法：细菌培养将各种菌种室温解冻后，按照四区法
分别接种于MH 平板培养基，置于37ħ细菌培养箱中，培养24h 。每种细菌取三株，分别标为A 、B 、C 组，取单个菌落接
种于LB 液体培养基中，培养至OD620值约0.5；rhBD-3原液配置将rhBD-3冻干粉用LB 液体培养溶解，使其最终浓度为
128μg /ml ；抑菌实验每株取8管，分别按顺序编号，分别加入LB 液体培养基2ml ，在各自的第一管中加入含rhBD-3的LB 液体2ml ，混匀后按照倍比稀释法，浓度分别为64μg /ml 、32μg /ml 、16μg /ml 、8μg /ml 、4μg /ml 、2μg /ml 、1μg /ml ，第8管加入2ml LB 液体作为对照；分别吸取每种细菌已配置好的LB 菌液0.1ml 加入A 、B 、C 组各管中，每个浓度重复3管，所得结果取三管平均值，所有菌液37ħ震荡培养16h 。紫外光谱分析仪测定OD620值将波长设置为620nm ，分别测定菌液的吸光光度值OD620，值越高，细菌浓度越高，计算公式为：细菌数/ml =OD620*5*107/0.2；杀菌浓度测定分别取各管中LB 培养液0.1ml ，置于MH 培养皿中培养24h ，观察有无细菌生长。
三、统计学处理：采用SPSS 13.0软件进行统计学分析，资料间的比较用t 检验。
结
果
rhBD-3浓度＜2μg /ml 时，防御素组OD 值与对照组OD
值无统计学差异（P ＞0.05）；而rhBD-
3浓度在4 16μg /ml 5
54临床肺科杂志2013年3月第18卷第3期
时，防御素组OD值与对照组OD值有统计学差异（P= 0.0060），当rhBD-3浓度＞16μg时，OD值明显下降，如下表。
表1不同rhBD-3浓度下平均OD值变化比较
rhBD-3浓度（μg/ml）铜绿假
单胞菌
鲍曼
不动杆菌
大肠
埃希菌
金黄
葡萄球菌
11．170．941．011．05 20．950．860．720．75 40．550．050．270．26 80．110．050．030．03 160．030．030．010．01
对照组1．181．021．011．04
rhBD-3的最低抑菌浓度与最低杀菌浓度rhBD-3浓度为1μg/ml时，4种细菌的OD值与对照组相比，无统计学差异（P＞0.05），分别取各管中LB菌液0.1ml，置于MH培养皿中培养24h，MH培养基上有细菌生长，rhBD-3浓度在2 8μg/ml时，细菌生长随rhBD-3浓度增加明显受抑，将无细菌生长的相对应的rhBD-3浓度记为最低抑菌浓度（MIC），取4种细菌的OD平均值与对照组OD平均值比较，差异有统计学意义（P=0.0030）；当rhBD-3浓度＞16μg时，MH培养基中无细菌生长，相对应的rhBD-3浓度记为最低杀菌浓度（MBC）。什么是丁克一族
表2rhBD-3对不同菌株的抗菌活性差异（μg/ml）
项目铜绿假单胞菌
A B C
鲍曼不动杆菌
A B C
大肠埃希菌
A B C
金黄葡萄球菌
A B C
最低抑菌浓度448484442424
最低杀菌浓度8816816816881688
rhBD-3与抗生素MIC平均值比较通过琼脂弥散法分别测定亚胺培南、头孢吡肟、左氧氟沙星、阿米卡星对铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌的MIC平均值，并与rh-BD-3的MIC平均值比较。亚胺培南、头孢吡肟、阿米卡星与rhBD-3对铜绿假单胞菌的MIC值差异有统计学意义（P＜0.05）；4种抗生素与rhBD-3对鲍曼不动杆菌MIC值差异有统计学意义（P＜0.05）；头孢吡肟与rhBD-3对铜绿假单胞菌的MIC值差异有统计学意义（P＜0.05）。
表3rhBD-3与抗生素对不同细菌MIC值比较（μg/ml）
细菌亚胺培南
A B C
头孢吡肟
A B C
左氧氟沙星
A B C
阿米卡星
A B C
rhBD-3
A B C
铜绿假单胞菌416162321628481632448鲍曼不动杆菌32323216323281616326432484大肠埃希菌164432321681648881688注：以上抗生素对细菌的MIC值均通过琼脂稀释法测定。
讨论
抗菌肽作为天然免疫分子，是先天免疫系统的重要组成部分，哺乳动物体内存在两类抗菌肽：defensin（防御素）和cathelicidin。防御素具有快速识别和清除病原微生物为其特征，是宿主防御素系统第一道防线的重要组成部分。可分为5种类型，即α-防御素，β-防御素，θ-防御素，昆虫防御素，植物防御素。β-防御素3是具有广谱抗菌活性的阳离子抗菌肽，相对于其他防御素，β-防御素3是非盐离子敏感性防御素，即在囊性纤维化患者的呼吸道黏膜高盐状态下，也能有良好的抗菌活性，且对院内感染的多耐药菌株也有良好的抗菌活性。Schibli et al［2］研究表明，在低浓度的水溶液中β-防御素3能形成二聚体，即两性二聚体结构，并且β-防御素3表面的正电荷比β-防御素1、β-防御素2明显增多，这些特性使β-防御素3抗菌活性明显强于β-防御素1、β-防御素2。β-防御素3在呼吸系统主要由支气管上皮及肺泡上皮细胞产
生，在正常情况下低水平表达，在细菌性肺炎患者的体内，急性感染时相，β-防御素3的表达水平提高，治愈后表达水平降低［3］。
防御素的活动机制涉及细胞膜的通透性，防御素的确切作用机制尚未明确，不同的抗菌肽作用方式和机制不同，这种相对非特异性的膜渗透机制，使耐药细菌的发生率罕见。目前普遍认可的机制：β-防御素3依靠带正电的两性分子特征，吸附于带负电的微生物表面，破坏磷脂双分子层，并插入其胞膜，形成通道，导致细胞内大分子、盐类外流［4］，最终导致菌体被破坏。但β-防御素3对于骨架系统较为发达的哺乳动物细胞并无损害。
细菌耐药已成为全球范围内重大公共卫生问题。近年来，抗菌药物的开发速度明显减慢，与此同时，细菌耐药却日趋严重。2005 2010年CHINET中国细菌耐药性监测结果均显示细菌耐药性呈增长性趋势，2010年CHINET监测结果［5］显示临床分离菌株47850株中，46．9%菌株自呼吸道标本中分离，肠杆菌科细菌中最多见者依次为大肠埃希菌、克雷伯菌属。革兰阳性菌中最多见者依次为金葡菌、肠球菌和凝固酶阴性葡萄球菌（只包括血液、脑脊液等无菌体液中的分离菌）。监测结果显示，铜绿假单胞菌对亚胺培南、美罗培南的耐药率30.8%和25.8%，不动杆菌属中89.6%为鲍曼不动杆菌，该菌除对头孢哌酮－舒巴坦的耐药率为30.7%，对其他所测试药物的耐药率均在50%以上。大肠埃希菌对喹诺酮类药物、庆大霉素、哌拉西林的耐药率均高于50%。近年国内外均出现了碳青霉烯抗生素肠杆菌科细菌和不发酵革兰阴性杆菌增多的报道。此种耐药菌往往多重耐药或泛耐药，其耐药机制极其复杂，所致感染在
全球范围内均有发生，并可造成局部暴发流行。国内有研究表明，对革兰阳性菌的最低抑菌浓度为4μg/ml，对革兰阴性菌的最低抑菌浓度为8μg/ ml［6］。机械通气可能抑制免疫功能正常的大鼠体内β-防御素3的表达水平下调，相应的向这些大鼠支气管内接种细菌，β-防御素3表达下调的大鼠体内则发生呼吸机相关性肺炎，由此可判断β-防御素3具有抑菌作用，且影响表达水平因素较多［7］。此外，β-防御素3具有抑制铜绿假单胞菌的生物膜的形成，并对早期和成熟期的生物膜具有破坏作用［8］。本实验选用下呼吸道分离的常见多耐药菌株铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、大肠埃希菌、金黄葡萄球菌，实验结果表明rh-BD-3对临床多耐药菌株具有显著抗菌作用，低浓度的rhBD-3具有良好的抗菌活性，并且在一定的浓度范围内具有浓度依
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耐性。rhBD-3对不同细菌的MIC值浓度在4 16μg/ml，与抗生素相比，其MIC值小于部分抗生素MIC值，并且有统计学意义。
当然，β-防御素3的抗菌活性还需要进一步验证。目前，β-防御素3的生物学功能大部分都是基于体外研究，体内应用途径及价值还需要通过相应动物模型深入探索。
参考文献
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－7．
［收稿日期:2012－11－15］
沙美特罗氟替卡松联合噻托溴胺中重度COPD的临床观察戴莉莉秦斌斌陈晓红冯洁金烨沈斌卢明
【摘要】目的观察沙美特罗氟替卡松（舒利迭）联合噻托溴胺（思力华）中重度COPD患者的临床疗效。方法将60例中重度COPD稳定期患者随机分成两组，A组：吸入舒利迭（50μg/250μg）2次/d，吸入思力华（18μg）1次/d；B组：吸入舒利迭（50μg/250μg）2次/d，疗程3个月。以两组前后的血气分析、肺功能、6分钟步行试验为观察指标。结果A组的血气分析、肺功能、6MWT与B组相比较差异有统计学意义（P＜0.05）。结论沙美特罗氟替卡松与噻托溴胺联合中重度COPD 患者的效果确切，值得推广。
【关键词】沙美特罗氟替卡松；噻托溴胺；慢性阻塞性肺疾病；肺功能
Clinical observation of salmeterol fluticasone combined with tiotropium in the treatment of patients with chronic obstructive pulmonary disease at moderate and severe stages DAI Li-li，QIN Bin-bin，CHEN Xiao-hong，Feng Jie，JIN Ye，SHEN Bin，LU Ming the Second People's Hospital of Shanghai，Shanghai200011，China 【Abstract】Objective To observe the effects of salmeterol fluticasone（Seretide）combined with tiotropium（Spiriva）in the treatment of patients with chronic obstructive pulmonary disease（COPD）at moderate and severe stages．Methods60COPD patients at moderate and severe stages were randomly divided into two groups．The group A received Seretide inhalation50μg/250μg twice a day and Spiriva inhalation18μg once a day．The group B received Seretide inhalation50μg/250μg twice a day only．The total treatment course was3months．The blood
gas analysis，lung function，and6-min walking distance were analyzed before and after treatment between the two groups．Results The differences of blood gas analysis，lung function，6-minute walking distance between the two groups showed statistical significance（P＜0.05）．Conclusion Salmeterol fluticasone combined with tiotropium has better curative effect in the treat-ment of COPD patients at moderate and severe stages and it's worth to be promoted and applied in clinical practice．【Key words】salmeterol fluticasone；tiotropium；chronic obstructive pulmonary disease；lung function
慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种常见的呼吸系统慢性疾病，是严重危害人类健康的疾病之一，其发病率和死亡率逐年增加。COPD具有气流受限不完全可逆的特征，呈进行性发展，最终导致呼吸功能严重受损，活动耐力及生活质量下降。COPD的目的是迅速缓解症状，预防疾病的进展，改善运动耐力及健康状况，预防和疾病急性加重，延缓肺功能进一步的恶化，降低病死率［1］。本文旨在观察沙美特罗氟
doi：10．3969/j．issn．1009－6663．2013．03．034
作者单位：200011上海，上海市第二人民医院呼吸科替卡松（舒利迭）联合噻托溴胺（思力华）吸入中重度COPD患者的作用。
资料与方法
一、选择2011年1月 2012年1月我院呼吸科门诊就治的COPD稳定期Ⅱ Ⅲ级（中、重度）患者60例，所入选病例均符合2007年版慢性阻塞性肺疾病全球倡议（GOLD）诊断标准［1］，男32例，女28例，年龄50 68岁，入选患者近2周无急性发作史，未使用糖皮质激素，无严重的心、肝、肾等全身性疾病，无神经系统疾病、青光眼、前列腺增生症。将患者使
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临床肺科杂志2013年3月第18卷第3期
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