MRSAPBP2a表达的影响因素及MecA基因的检测价值
MRSA PBP2a表达的影响因素及MecA基因的检测价值
吴本权,唐英春,张扣兴,张天托
(中山医科大学附属第三医院内科,广东广州 510630)
摘 要: 目的 探讨温度、pH、盐浓度对甲氧西林耐药金葡菌(methicillin-resistant staphy lococcus aur eus,M RSA)青霉素结合蛋白2a(penicillin-binding protein,PBP)表达的影响,以及PBP2a编码基因M ecA的检测价值。 方法 采用聚合酶链式反应(PCR)检测M RSA特异性M ecA基因和美国临床实验室标准委员会(N CCLS)推荐的琼脂板稀释法(32 ,pH7 2,40g/L N aCl 苯唑西林M IC 4mg/L)筛选M RSA。检测20株M RSA在不同温度、pH、盐浓度时对苯唑西林、头孢唑林和头孢他啶的体外药物敏感性,测定M IC范围,M IC50和M IC90;SDS-PAGE分析10株M RSA膜青霉素结合蛋白(PBP2a)在不同培养条件时表达数量的差异,并进行配对差值的t检验。 结果 180株金葡菌检测出M ecA基因阳性M RSA56株,按琼脂板稀释法检出52株M RSA,4株未被检出(苯唑西林M IC分别为:2,2,1,0 5mg/L),37 、pH5 2和9g/L NaCl分别与32 、pH7 2和40g/ L NaCl条件下诱导10株M RSA,所表达的PBP2a含量前后比较差值有显著性(P 0.02~0.05,0.01~0.005,0.02~0.05)。 结论 不同温度、pH、盐浓度通过诱导耐药蛋白PBP2a的表达明显影响M RSA对苯唑西林、头孢唑林和头孢他啶耐药水平,而其M ecA基因却不受培养条件的影响,可以快速检测M R SA感染。
关键词:蛋白质结合;甲氧西林抗药性;葡萄球菌,金黄;聚合酶链反应
中图分类号:R378 1  文献标识码:A  文章编号:1000-257X(2000)02-0157-04
Factor Influencing PBP2a Expression and the Significance
of Detecting MecA Gene in MRSA
WU Ben-quan,TANG Ying-chun,ZHANG Kou-x ing,ZHANG T ian-tuo
(Department of Internal M edicine,T hird Affiliated Hospital of
Sun Y at-sen U niversity of M edical Sciences,Guangzhou510630,China)
Abstract: Objective To investigate effect of culture conditions on PBP2a expression and significance of its M ecA gene detected by PCR in MRSA. Methods MRSA were identified by their specific MecA gene and agar plate dilution method recommended by NCCLS(32 ,pH7.2,40g/L NaCl,ox acillin M IC 4mg/L).The antimicrobial activities of oxacillin,cefazolin and ceftazidime against20MRSA at different culture conditions w ere tested and MIC range,M IC50and M IC90w ere counted and the relative amount of PBP2a in10M RSA w ere analyzed by SDS-PAGE.Statistical signifcance was analyzed w ith
t-tests. Results 56M RSA w ere isolated from 180strains staphylococcus aureus through detecting M ecA,but only52M RSA were idendified using agar plate dilution method and4strains w ere missing for test(M IC of oxacillin2,2,1,0 5ug/ml,respectively).In add-i tion,the amount of PBP2a in10MRSA at37 ,pH5 2and9g/L NaCl were low er than32 ,pH7 2,and40g/ L NaCl(P:0 02~0 05,0 01~0 005,0 02~0 05). Conclusion T he results show ed that temperature,pH and concentration of salt have apparent effects on antimicrobial activities of oxacillin,cefazolin and ceftazidime a-g ainst MRSA,but the detection of M ecA gene may be used to diagnose M RSA infection earlier,without influ-enced by culture conditions.
Key words:protein binding;methicillin resistance;staphylococcus aureus;polymerase chain reaction
收稿日期:1999-11-03
作者简介:吴本权(1964-),男,广东广州人,硕士,讲师.
耐甲氧西林金葡菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)呈高度多重耐药,其感染病死率极高,早期诊断十分重要,但目前还没有可靠的鉴定方法[1]。各地检出的MRSA占金葡菌的比例相差较大[2],常常漏诊,并因盲目大剂量使用 -内酰胺抗生素诱导出高度耐药的M RSA。因此探讨培养条件对M RSA耐药性影响及其机制,寻理想的诊断方法有重要意义。我们比较不同培养条件对MRSA耐药性影响及其对耐药蛋白PBP2a(Pencillin-Binding-Protein,PBP2a)的诱导作用,并就PBP2a的编码基因M ec
A检测与目前美国临床实验室标准委员会(NCCLS)推荐的方法对M RSA诊断价值作比较。
1 材料和方法
1.1 菌 种
180株金葡菌是从我院1995~1997年住院病人的痰标本中分离,按NCCLS推荐的琼脂板稀释法筛选52株MRSA,M RSA特异性MecA基因检测56株阳性。
1.2 主要试剂和配制方法
用于M RSA鉴定的引物为M ecA基因文库中623bp(位置5 -1321~1943bp)的特异性片段:序列1,5 -AGTTGTAGTT GTCGGGTTT G-3 ;序列2,5 -AGTGGAACGAAGGTACATC-3 。LB培养基(修改):NaCl40g,酵母浸膏5g,胰蛋白胨10g,蒸馏水1L;Mueller Hinton:牛肉浸膏2g,水解酪蛋白17 5g,淀粉1 5g,蒸馏水1L,苯唑西林(美国Sigma公司),头孢唑林(日本藤泽药品工业株式会社),头孢他啶(英国葛兰素公司)。Lyostaphin (50mg/L),脱氧胆酸钠(10g/L)(美国Sig ma公司),磷酸钠缓冲液(50mmol/L Na3PO4,10mmol/ L MgCl2,pH7 2)。
1.3 MRSA鉴定方法
琼脂板稀释法:参照NCCLS标准,将保存的180株金葡菌转种至LB培养基培养24h,配成1010CFU/L的细菌悬液,沾取2 L接种在琼脂板上,苯唑西林M IC 4mg/L为MRSA。PCR检测MRSA特异性Mec A基因。条件参照文献[3]。1.4 体外药物敏感试验
苯唑西林,头孢唑林,头孢他啶按对倍稀释法加入不同pH和不同盐浓度的M-H平板中,借助多头接种仪接种20株M RSA(107CFU/L)至上述平板中,在32 和37 两种温度中分别孵育24h后观察结果,测抗生素的抑菌范围及M IC50和M IC90。
1.5 PBP2a的诱导
从L-B平板挑取单个MRSA菌落至10mL不同pH、不同盐浓度的LB液体培养基中在32 和37 两种不同温度中振荡过夜,再转种至300mL 同样条件的LB培养基至对数生长期,离心收集细菌加入葡萄球菌溶菌素超声粉碎(20kHz,10s,10次),4000g,4 离心15m in,上清液100000g,4 离心60min,调节膜片浓度4mg/L,加入脱氧胆酸钠(10g/L)10000g离心10min,上清膜蛋白行SDS-PAGE,用分光光度扫描仪测定PBP2a的相对含量[4]。
2 结 果
2.1 培养条件对 -内酰胺药物的抗MRSA活性的影响
在32 ,pH7 2,40g/L NaCl时耐药性较强,苯唑西林,头孢唑林和头孢他啶的M IC50、M IC90分别为200,400,400,1600,800,1600mg/L。依次改变培养条件后MIC50、M IC90均有不同程度下降(表
1)。
2.2 MRSA MecA基因的检测价值
PCR检测180株金葡菌是否为携带MecA基因的M RSA,结果56株金葡菌MecA基因阳性,按
表1 不同培养条件对M RSA体外药物敏感性的影响
T able1 Effects of different culture co nditions on the antimicrobial susceptibilit yo in v itr o of M R SA  ( B/mg L-1)
Rang e
Oxacillin Cefazolin Ceftazidime
M IC50
Oxacillin Cefazolin Ceftazidime
M IC90
O xacillin Cefazolin Ceftazidime
32  50~800 50~1600100~1600  200  400  800 400 1600 1600 37    3.12~400  6.25~400 25~80050100100400400800 NaCl(9g/L)1.56~50  3.12~100  6.25~200  3.1212.512.525100100
NCCLS(32 ,pH 7 2,40g/L NaCl,苯唑西林M IC  4mg/L)标准有4株漏检(苯唑西林MIC:2,2,1,0 5mg/L),M ecA 基因检测却不受外界因素的影响[5],可以提高低度耐药菌的检出(图1)
图1 MRSA 特异性MecA 基因PC R 检测结果Fig.1 The results of specific MecA gene of
MRSA detected by PCR
1:control;2:posi tive control;3~16:M RSA;17:marker;The re -sults of agrose gel electrophotogram of PCR products show ed that M ecA gene w ith 623bp existed in all 56M RSA and positi ve control,but didn  t in negative control
2.3 温度、pH 和盐浓度对MRSA PBP 2a 表达的影响10株MRSA 在32 ,pH7 2,40g /L NaCl 诱导的PBP 2a 明显高于37 ,pH 5 2及9g/L NaCl (表2)。
表2 温度、pH 和盐浓度对10株M RSA PBP 2a 的诱导作用
T able 2 Inducing effects of temperatur e,pH and salt
on PBP 2a in 10strains M RSA
x  s
t
P
32 11.65 4.0037 10.59 2.91  2.6160.02~0.05pH 7.213.64 4.27pH 5.2
7.26 3.40  3.2750.01~0.005NaCl(40g /L )12.32 3.15NaCl(9g/L)
8.89 4.34
2.368
0.02~0.053 讨 论
20年代青霉素问世以来,金葡菌逐渐产生水解青霉素的 -内酰胺酶造成抗菌失败,随后人们开发出对 -内酰胺酶稳定的半合成青霉素如苯唑西林和甲氧西林。60年代Jevons 首次报道耐甲氧西林金葡菌(MRSA)[6]后,M RSA 对包括甲氧西林在内的所有抗生素耐药,目前只有万古霉素对其敏感
[7]
,并且MRSA 的分离率越来越高,呈世界流
行。1982年Yotota 发现MRSA 除金葡菌具有的PBP 1,2,3,4外,新出现一种PBP 2a (78ku),不同于其
它PBP,对 -内酰胺抗生素亲合性极低,是MRSA 耐药的主要原因[4]
。所有MRSA 都有PBP 2a 及其编码基因MecA,M ecA 表达受多种因素的影响,造成M RSA 耐药的变异。但MecA 基因的检测不受培养条件的影响[5],与耐药程度无关[9],因而受到临床的广泛关注。M RSA 高危多重耐药,其感染病死率极高,美国临床实验室标准委员会推荐的琼脂板对倍稀释法,在32 ,pH 7 2和40g/l NaCl 培养24h,苯唑西林M IC  4mg/L 为M RSA 。由于受种种因素的影响及M RSA 本身耐药的异质性,对临
界点浓度的判断也存在不同的标准,国内报告的分
离率差异较大,造成诸多差异的原因是由于培养条件的不同诱导MRSA 耐药水平的改变。
我们在不同培养条件下比较苯唑西林,头孢唑林和头孢他啶对M RSA 的体外抗菌活性,在32 、pH 7 2和40g /L NaCl 时耐药性最强,当培养条件改变为37 、pH 5 2和9g/L NaCl 时耐药性有不同程度下降,特别是pH 值改变影响最明显,3种抗生素的M IC 90分别下降128倍、256倍和64倍。培养条件明显影响MRSA 的诊断。按琼脂板稀释法有4株低度耐药菌漏检。M RSA 对 -内酰胺抗生素耐药主要与M ecA 基因编码的PBP 2a 有关,本实验显示:耐药性增高的MRSA 其PBP 2a 表达增多,温度、pH 和盐浓度改变所诱导的PBP 2a 含量亦不同。MecI 和M ecR1为MecA 的操纵基因[8],理化因素可活化辅助诱导因子MecR1,致抑制子M ecI 失活,MecA 表达大量PBP 2a ,MRSA 耐药水平增高。受培养条件的影响,M RSA
对 -内酰胺耐药呈现不均一性,按M IC 标准判断,因条件不同出现M IC 值偏差,可造成MRSA 漏检,而通过MecA 基因检测得以确诊。盲目使用 -内酰胺抗生素漏检的MRSA 则可诱导致命的耐药株,值得临床高度重视。PCR 检测快速简便,特别适用低度耐药菌的诊断。为了避免假阳性或假阴性,必须注意扩增条件的质控,设阳性和阴性对照,严格无菌操作程序。荧光定量PCR 和巢式PCR 可提高特异性和敏感性。也有作者提出用PBP 2a 单抗准确诊断真正意义的MRSA (表达PBP 2a ),但由于受MecA 基因活化程度的影响,有时表达极微,难以检出[9]。
参考文献:
[1]R ichard P ,M eyran M ,Carpentier E,et al.Compar ison
(下转封3页)
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第2期 吴本权,等.M RSA PBP 2a 表达的影响因素及M ecA 基因的检测价值
一个病理过程,也是导致神经系统病变进一步发展的重要环节[2,3]。国外报道它与神经精神性狼疮明
显相关,而且对弥漫性狼疮脑病的诊断更有意义[4]。文献记载10年的前瞻性研究证实抗神经元抗体诊断
弥漫性狼疮脑病敏感性为100%,特异性为86%。本研究方法(免疫组化)的敏感性40%,特异性为93%,虽然其敏感性不及放免法,但更具特异性(在系统性红斑狼疮患者中特异性为93%,在其它患者中特异性为100%)。以人脑为基质的抗神经元抗体检测对临床诊断神经精神性狼疮有很大的帮助,实用性明显优于脑CT、MR等检查方法[5]。既往抗神经元抗体检测一直沿用SK-N-SH神经胚胎瘤细胞为基质的检测方法,而且在国内未得到开展。这不仅是由于对抗神经元抗体的意义缺少充分的认识,同时也与其检测繁琐有关。我们采用间接免疫荧光的方法大大简化了操作步骤,并能较快取得结果,便于临床推广应用。参考文献:
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(编辑 黄小延)
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