实验14 叶绿素a和b含量的测定(分光光度法)
一、目的
学会Chla、b含量的测定方法,了解叶片中Chla、b的含量。
二、材料用具及仪器药品
菠菜叶片、721分光光度计、天平、研钵、剪刀、容量瓶(25ml)、漏斗、滤纸、乙醇(95%)
三、原理
叶绿素a、b在波长方面的最大吸收峰位于665nm和649nm,同时在该波长时叶绿素a、b的比吸收系数K为已知,我们即可以根据Lambert Beer定律,列出浓度C与光密度D之间的关系式:
D665=83.31Ca+18.60Cb…………………………….(1)
D649=24.54Ca+44.24 Cb…………………………….(2)
(1)(2)式中的D665、D649为叶绿素溶液在波长665nm和649nm时的光密度。
为叶绿素a、b的浓度、单位为每升克数。
82.04、9.27为叶绿素a、b在、在波长665nm时的比吸收系数。
16.75、45.6为叶绿素a、b在、在波长649nm时的比吸收系数。
解方程式(1)(2),则得 :
CA=13.7 D665—5.76 D649………………………(3)
CB掇怎么读=25.8 D649—7.6 D665……………………… (4)
G=CA+CB=6.10 D665+20.04 D649………(5)
此时,G为总叶绿素浓度,CA、CB为叶绿素a、b浓度,单位为每升毫克,利用上面(3)(4)(5)式,即可以计算叶绿素a、b及总叶绿素的总含量。
四、方法步骤
1.称取0.1克新鲜叶片,剪碎,放在研钵中,加入乙醇10ml共研磨成匀浆,再加5ml乙醇,过滤,最后将滤液用乙醇定容到25ml。
2.取一光径为1cm的比杯,注入上述的叶绿素乙醇溶液,另加乙醇注入另一同样规格的比杯中,作为对照,在721分光光度计下分别以665nm和649nm波长测出该素液的光密度。
计算结果:
叶绿素a含量(mg/g. FW)=
叶绿素b含量(mg/g.FW)=
叶绿素总量(mg/g.FW)=
五、实验报告
计算所测植物材料的叶绿素含量。
六、思考题
测定叶绿素a、b含量为什么要选用红光的波长?
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