mRNA疫苗及其制备方法和应用发明专利
mRNA疫苗及其制备方法和应用
技术领域
本公开属于生物技术领域，具体涉及一种mRNA，及其制备方法和应用。
背景技术
严重急性呼吸系统综合症冠状病毒(SARS-CoV-2，新冠病毒)是一种有包膜的正义单链RNA病毒，可导致新型冠状病毒病(COVID-19)，引发机体产生发热、乏力、干咳等症状，严重的还容易引起呼吸困难，最终导致死亡。
新冠病毒颗粒的结构包括入侵宿主细胞所需的遗传物质RNA和结构蛋白。新冠病毒侵染细胞后，遗传物质RNA被用来编码构成病毒颗粒的结构蛋白，指导病毒组装、转录、复制和宿主控制的非结构蛋白，以及功能尚未确定的辅助蛋白。SARS-CoV-2的结构蛋白包括包膜(E)蛋白、表面刺突(S)蛋白、膜(M)蛋白和核衣壳(N)蛋白。S蛋白位于病毒颗粒的外部，介导新冠病毒颗粒的附着和进入宿主细胞，是新冠疫苗开发、抗体疗法和基于抗原的诊断测试的主要靶标。
S蛋白是新冠病毒的主要免疫原区域，绝大多数疫苗免疫后产生的中和抗体及恢复期患者血清中的中和抗体均由S蛋白的受体结合结构域(RBD)产生。最近有报道发现，S蛋白的S1/S2连接处的弗林酶切位点缺失或突变会请确认引起新冠病毒在Vero细胞中呈现复制增强，在动物中呈现毒力减弱的状态，且这种含有弗林酶切位点缺失的病毒能够诱导产生很强的体液免疫和细胞免疫反应。
截止到2021年8月9日，由COVID-19引发的疫情在全世界范围内累计确诊病例达到202935805例，累计死亡病例4298483例。目前，已有灭活疫苗、重组蛋白疫苗、mRNA疫苗、腺病毒载体疫苗、减毒流感病毒载体疫苗等新冠疫苗陆续上市或进入临床试验阶段。在保证安全性的前提下，如何获得一种免疫原性更好的新冠疫苗，是新冠疫苗开发设计的重要目标。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述技术问题之一，本公开对新冠病毒SARS-CoV-2中表达S蛋白的mRNA核酸序列进行了改造，提供了一种免疫原性得到显著提高的mRNA序列，可用于新冠疫苗的开发。
根据本公开的一个方面，提供了一种分离的mRNA，所述mRNA编码重组表面刺突(S)蛋白，所述重组S蛋白来源于严重急性呼吸系统综合症冠状病毒(SARS-CoV-2)，且包含在N末端结构域中的缺失和弗林酶切位点结构域的缺失。本公开的S蛋白mRNA具有与新冠病毒野生型毒株的S蛋白mRNA相比显著提高的免疫原性。
根据本公开的一些实施方式，所述SARS-CoV-2可以选自Wuhan-Hu-1病毒株、P.1病毒株、P.2病毒株、B.1.351病毒株、B.1.1.7病毒株、C.37病毒株或B.1.617.2病毒株。根据本公开的一些实施方式，所述mRNA表达的S蛋白可以具有如SEQ ID NO:1～7中任一项所示的氨基酸序列。根据本公开的一些实施方式，所述mRNA表达的S蛋白可以具有与SEQ ID NO:1～7中任一项所示的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列，例如，具有与SEQ IDNO:1～7中任一项所示的氨基酸序列具有至少85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性的序列。
根据本公开的一些实施方式，所述N末端结构域中可以包括如IX 1X 2ntdSGTNX 3X 4所示的序列的缺失，其中X 1不存在或者选自组氨酸，X 2不存在或者选自缬氨酸，X 3选自甘氨酸或缬氨酸，和/或X 4选自苏氨酸或异亮氨酸。根据本公开的一些实施方式，所述N末端结构域中可以包括如SEQ ID NO:8～10中任一项所示的氨基酸序列的缺失。
根据本公开的一些实施方式，所述弗林酶切位点结构域的缺失包括如X 5RRAR所示的序列的缺失，其中X 5选自组氨酸、精氨酸或脯氨酸。根据本公开的一些实施方式，所述弗林酶切位点结构域的缺失包括如SEQ ID NO:11～13中任一项所示的氨基酸序列的缺失。
根据本公开的一些实施方式，所述mRNA表达的S蛋白可以具有如SEQ ID NO:14～20中任一项所示的氨基酸序列。根据本公开的一些实施方式，所述mRNA表达的S蛋白可以具有与SEQ ID NO:14～20中任一项所示的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列，例如，具有与SEQ ID NO:14～20中任一项所示的氨基酸序列具有至少85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％同一性的序列。
根据本公开的一些实施方式，所述mRNA还可以包括：5’UTR序列、3’UTR序列和多聚腺苷酸(PolyA)序列。根据本公开的一些实施方式，所述mRNA按照从5’到3’的方向可以依次包括：5’UTR序列、编码的所述重组S蛋白的序列、3’UTR序列和多聚腺苷酸序列。根据本公开的一些实施方式，所述mRNA的5’端还可以包括在5’帽结构。
根据本公开的另一方面，提供了一种编码如上所述的mRNA的DNA序列。
根据本公开的又一方面，提供了一种递送系统，所述递送系统包括如上所述的mRNA。
根据本公开的又一方面，提供了如上所述的mRNA、如上所述的DNA序列、如上所述的递送系统，在制备用于对象的SARS-CoV-2疫苗中的用途。根据本公开的一些实施方式，所述对象可以包括哺乳动物，优选为人、猴、骆驼、牛、马、山羊、绵羊、猪、猫、狗、兔、小鼠或大鼠。本公开的mRNA或DNA可以根据对象的不同，而对RNA或DNA序列进行优化。
根据本公开的又一方面，提供了一种用于制备如上所述的mRNA的方法。根据本公开的一些实施方式，所述方法包括：对来源于严重急性呼吸系统综合症冠状病毒(SARS-CoV-2)的S蛋白mRNA进行改造，其表达的S蛋白在N末端结构域和弗林酶切位点结构域存在缺失。
根据本公开的一些方式，所示方法包括以下步骤：在编码上述S蛋白的核苷酸序列的两端加上5’UTR和3’UTR，以及多聚腺苷酸(PolyA)尾。筛选正确的重组子，用重组子转化大肠杆菌，获得大量纯净的质粒后，进行体外mRNA转录及mRNA的纯化。纯化的mRNA通过脂质体包裹，形成纳米脂质颗粒，可以用作新冠候选mRNA疫苗。
本公开通过实验证明，由于弗林酶切位点的缺失会导致S1和S2处的连接无法断开，因而更好的保证S蛋白的完整性，从而能够诱导产生很强的体液免疫和细胞免疫反应。本公开获得的mRNA变体相比于新冠病毒原型株S蛋白mRNA的免疫原性显著提高，因此是作为免疫原
或抗原用于免疫对象的理想疫苗候选蛋白。
定义
除非另有定义，否则本公开使用的所有技术术语和科技术语都具有如在本公开所属领域中通常使用的相同含义。出于解释本说明书的目的，将应用以下定义，并且在适当时，以单数形式使用的术语也将包括复数形式，反之亦然。
除非上下文另有明确说明，否则本文所用的表述“一种”和“一个”包括复数指代。例如，提及“一个细胞”包括多个这样的细胞及本领域技术人员可知晓的等同物等等。
本文所用的术语“约”表示其后的数值的±20％的范围。在一些实施方式中，术语“约”表示其后的数值的±10％的范围。在一些实施方式中，术语“约”表示其后的数值的±5％的范围。
SARS-CoV-2病毒颗粒的S蛋白与细胞表面受体血管紧张素转化酶2(ACE2)结合，以促进其进入细胞。由于S蛋白对于病毒进入至关重要，因此它已成为疫苗开发和性抗体干预的目标。SARS-CoV-2的S蛋白被弗林酶(Furin)切割，产生S1和S2片段。S1蛋白包括N末端结构域(NTD)和受体结合结构域域(RBD)，而S2蛋白促进膜融合。
目前发现了七株SARS-CoV-2病毒，即Wuhan-Hu-1病毒株、P.1(Gamma)病毒株、P.2(Zeta)病毒株、B.1.351(Beta)病毒株、B.1.1.7(Alpha)病毒株、C.37(Lambda)病毒株或B.1.617.2(Delta)病毒株。Wuhan-Hu-1病毒株的S蛋白具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。P.1(Gamma)病毒株的S蛋白具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。P.2(Zeta)病毒株的S蛋白具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。B.1.351(Beta)病毒株的S蛋白具有如SEQ IDNO:4所示的氨基酸序列。B.1.1.7(Alpha)病毒株的S蛋白具有如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。C.37(Lambda)病毒株的S蛋白具有如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。B.1.617.2(Delta)病毒株的S蛋白具有如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。图1中示出了这七株毒株的S蛋白的序列比对结果。
下面提供实施例和附图以帮助理解本公开。但应理解，这些实施例和附图仅用于说明本公开，但不构成任何限制。本公开的实际保护范围在权利要求书中进行阐述。应理解，在不脱离本公开精神的情况下，可以进行任何修改和改变。
附图说明
图1示出了原始病毒株(Wuhan-Hu-1)、γ病毒株(P.1)、zeta(ζ)病毒株(P.2)、β病毒株(B.1.351)
、α病毒株(B.1.1.7)、λ病毒株(C.37)和δ病毒株(B.1.617.2)的S蛋白以及本公开的一种mRNA表达的S蛋白的氨基酸序列的对比。
图2示出了根据本公开一个实施方式的重组S蛋白的LNP(S-del-LNP)免疫动物后的IgG抗体效价检测。
图3示出了根据本公开一个实施方式的重组S蛋白的LNP(S-del-LNP)免疫动物后的中和抗体效价检测。
图4示出了根据本公开一个实施方式的重组S蛋白的LNP(S-del-LNP)的免疫动物后对细胞因子产生的影响。
图5示出了根据本公开一个实施方式的重组S蛋白的LNP(S-del-LNP)的免疫动物后免疫细胞的影响。
具体实施方式
为使本公开的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本公开进行进一步
的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本公开，并不用于构成对本公开的任何限制。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本公开的概念。这样的结构和技术在许多出版物中也进行了描述。
在以下说明中，省略了对公知技术的描述，以避免不必要地混淆本公开的概念。这样的技术在许多出版物，例如《分子克隆实验指南(第四版)》(冷泉港实验室科学出版社)中进行了描述。
实施例1
选取SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24所示的RNA序列，两端分别添加5’UTR和3’UTR，构建到pUC57质粒中，然后转化大肠杆菌。通过放大培养阳性菌株，提取大量质粒。质粒经过纯化，进行体外转录成mRNA。使用牛痘病毒加帽酶将mRNA5’端加帽为Cap0结构，使用2’-O-甲基转移酶进一步加帽为Cap1结构。后经过纯化，得到纯净的mRNA，用于脂质纳米颗粒(LNP)的制备。

版权声明：本站内容均来自互联网，仅供演示用，请勿用于商业和其他非法用途。如果侵犯了您的权益请与我们联系QQ:729038198，我们将在24小时内删除。