人参根际土壤微生物落结构与土壤环境因子的关系
赵雪淞，王力恒，骆世洪，等.人参根际土壤微生物落结构与土壤环境因子的关系[J].沈阳农业大学学报，2023，54（1）：27-35.
沈阳农业大学学报，2023，54(1)：27-35
Journal of
Shenyang Agricultural University http ：//syny.cbptki
DOI:10.3969/j.issn.1000-1700.2023.01.004
收稿日期：2023-01-06基金项目：国家自然科学基金项目（31870339）第一作者：赵雪淞(1971-)，女，博士，教授，博士生导师，从事生态修复理论与技术研究，E-mail:*****************
人参根际土壤微生物落结构与土壤环境因子的关系
赵雪淞1，王力恒1，骆世洪2，杨晨曦1，朱家佳3，高
欣1，陈洪磊3
（1.辽宁工程技术大学环境科学与工程学院，辽宁阜新123000；2.沈阳农业大学生物科学技术学院，沈阳
110161；
3.东北师范大学生命科学学院，长春130024）
摘
要：研究人参根际土壤微生物落与土壤环境因子的关系，为老参地土壤生态修复提供科学依据。采集森林土（G0）和3种
人参根际土壤（以下称G4、G5和G6），采用磷脂脂肪酸（PLFA ）法检测土壤微生物落组成结构，超高效液相谱-质谱/质谱（UPLC-MS/MS ）联用法测定土壤中8种人参皂苷单体（Rb 1、Rb 2、Rc 、Rd 、Rg 1、Re 、G-VXII 和F 2）的含量，化学方法测定土壤化学性质。结果表明：与G0相比，人参根际土壤PLFA 类型明显减少，总PLFA 含量和细菌PLFA 含量显著下降，而真菌PLFA 含量逐渐上升。随着种植年限的增加，人参皂苷Rb 1、Rb 2、Rc 、Rg 1和Re 在土壤中的相对含量下降，Rd 、G-VXII 和F 2相对含量升高。人参根际土壤综合肥力指数（IFI ）与G0相比显著下降（p <0.05）。冗余分析结果表明：土壤pH 值、有机质、全磷、速效磷、全氮与土壤细菌落丰度和真菌落丰度均正相关，土壤人参皂苷单体Rd 、G-VXII 和F 2含量与土壤真菌落丰度正相关。说明人参皂苷含量是导致人参根际土壤微生物落结构变化的关键环境因子。
关键词：人参；磷脂脂肪酸；土壤微生物落；土壤化学性质；人参皂苷中图分类号：S147.2文章编号：1000-1700（2023）01-0027-09
文献标识码：A
开放科学（资源服务）标识码（OSID):
Relationship Between Microbial Community Structure and Environmental
Factors in Ginseng Rhizosphere Soil
ZHAO Xue-song 1,WANG Li-heng 1,LUO Shi-hong 2,YANG Chen-xi 1,ZHU Jia-jia 3,
GAO Xin 1,CHEN Hong-lei 3
（1.College of Engineering and Technology,Liaoning Technical University,Fuxin Liaoning 123000,China;2.College of Biological Science and Technology,
Shenyang Agricultural University,Shenyang 110161,China;3.School of Life Sciences,Northeast Normal University,Changchun 130024,China ）
Abstract ：The relationship between microbial community structure and environmental factors in ginseng rhizosphere soil was researched in order to provide scientific basis for soil ecological restoration of old ginseng field.The soil microbial community structure and diversity of forest soil (G0)and ginseng rhizosphere soils (referred to as G4,G5,G6)were determined by phospholipid fatty acid (PLFA)method.The contents of ginsenoside monomers Rb 1,Rb 2,Rc,Rd,Rg 1,Re,G-VXII and F 2in soil samples were analyzed using ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry /mass spectrometry (UPLC-MS /MS).The soil chemical properties were determined by chemical method.The results showed that compared with G0,the PLFA species of ginseng rhizosphere soils were
significantly decreased,the total PLFA content and bacterial PLFA content decreased significantly,while the fungal PLFA content gradually increased.With the increase of planting years,the relative contents of ginsenosides Rb 1,Rb 2,Rc,Re and Rg1in the rhizosphere soils decreased,while the relative contents of Rd,G-VXII and F 2increased.Compared with G0,the soil integrated fertility index (IFI)decreased significantly (p <0.05).RDA analysis indicated that soil pH value,organic matter,total phosphorus,available phosphorus and total nitrogen were positively correlated with soil bacterial community abundance and fungal community
abundance,and the contents of soil ginsenoside monomers Rd,G-VXII and F 2was positively correlated with soil fungal community abundance.The contents of ginsenosides were the key environmental factors that led to the change of microbial community structure in ginseng rhizosphere soil.
Key words ：Panax ginseng ;phospholipid fatty acids;soil microbial community;soil chemical properties;
ginsenoside
--沈阳农业大学学报第54卷28
人参是名贵中药材，具有重要的药用价值和经济效益。由于野山参被过度挖掘，已难觅踪迹。人参栽培在我国有着悠久历史，但人参忌连作，忌地性强，对土质及生长环境条件要求严格，老参地土壤继续种植人参会引发严重的土传病害，导致减产甚至绝收。人参连作障碍严重制约人参产业的可持续发展。传统微生物检测方法和现代分子生物学技术研究均表明，人参连作后引起的土壤生态环境的改变有利于人参病原菌的生长，不利于土壤中有益微生物的生长，土壤微生物落结构失衡[1-6]。
在土壤中，植物根系通过分泌各种化学物质对根际微生物的种类、数量和分布产生影响，而根际微生物通过不同的响应机制对根系分泌物释放、土壤物质循环、能量流动、信息传递等产生重要影响，从而影响植物的生长发育和健康状况[7-9]。NICOL等[10-11]研究发现，西洋参（Panax quinquefolius）能在生长过程中通过根系向环境中释放人参皂苷，而人参皂苷能够促进西洋参锈腐病病原菌毁灭柱孢菌（Cylindrocarpon destructans）和根疫病病原菌畸雌腐霉（Pythium irregulare）的生长，抑制包括生防菌哈茨木霉菌（Trichoderma harzianum）在内的非病原菌的生长。后续研究发现，畸雌腐霉能产生降解人参皂苷的糖苷水解酶，水解二醇型人参皂苷产生低极性的水解产物人参皂苷F2[12]。IVANOV等[13]研究发现，人参皂苷具有化学趋化作用，能够吸引西洋参病原菌畸雌腐霉（P.irregulare）在富含人参皂
苷的根际聚集并加速生长。WANG等[14-15]研究了人参（Panax ginseng）根中的人参皂苷各级分及其单体与土壤真菌的互作关系，发现总人参皂苷、二醇型人参皂苷、人参皂苷单体Rb1、Rb2能够促进人参病原菌毁灭柱孢菌（C.destructans）生长，而毁灭柱孢菌能够产生胞外糖苷酶水解二醇型人参皂苷，该酶对人参皂苷的专一性与畸雌腐霉分泌的糖苷酶相似。此外，几种非人参病原菌的土壤真菌也能够降解人参皂苷，降解路径与毁灭柱孢菌相似。上述研究表明，人参皂苷进入根际土壤之后可能会增加人参病原真菌的丰度，改变微生物落结构，人参皂苷与土壤微生物落的互作可能是导致土壤微生物区系失衡、发生连作障碍的关键因子。人参皂苷与人参根际土壤微生物在落水平上的互作关系值得深入研究。
磷脂脂肪酸（PLFA）是活体微生物细胞膜的主要成分，不同区域不同类型土壤中的微生物可以通过不同的生理生化途径合成不同的PLFA。它对环境因素敏感，能够敏锐地反应土壤微生物落对土壤无机环境变化的响应，因此被用作“生物标签”来分析土壤菌微生物量和结构变化[16-17]。本研究利用PLFA技术研究不同种植年限的人参根际土壤微生物落结构及多样性变化，采用UPLC-MS/MS方法测定土壤中8种人参皂苷单体的含量，化学方法测定土壤化学性质并计算综合肥力指数（IFI）的变化，分析人参根际土壤微生物落与土壤环境因子的关系，为老参地土壤生态修复以及人参连作障碍的破解提供科学依据。
1材料与方法
1.1试验区概况
试验区位于吉林省白山市抚松县泉阳镇人参地（E127°01'~128°06'，N41°42'~42°49'），气候类型为大陆性高山气候，冬季寒冷漫长积雪深，夏季温热短暂雨量集中。年均降水量763~834mm，年平均气温为4℃，年平均日照2352.5h，日照率为53%，无霜期130d，土壤类型为黑钙土。
1.2土样采集
人参按照当地习惯进行种植[1-2]。种植人参之前，农田被森林土覆盖。人参种植2年后移栽至新样地（新样地仍然是被森林土覆盖的农田），再继续种植2，3，4年，土壤样品采集于2020年9月，种植年限分别为4（2+2）、5（2+3）和6（2+4）年的人参根际土壤（以下称G4、G5和G6），以未种植过人参的森林土（以下称G0，是新样地G4的森林土）作为对照。参床长20m，宽1.5m，高0.3m。从每个参床中随机选择10株健康人参连根挖起，通过刷根收集附着在人参根上的根际土壤，并汇集在一起作为1个样本，每个处理采集3个参床，共采集12个样本，记录采集地点、采集时间及生长年限，用自封袋装封土样并编号，用冰袋运回实验室，并分为两个子样品。一个子样品晒干后通过2mm筛用于土壤化学性质和人参皂苷含量分析；另一个子样品液氮冷冻后保存在-80℃下用于检测PLFA。采样点各年生人参田间管理措施一致。
1.3测定项目及方法
参考鲁如坤[18]的方法测定土壤化学性质；土壤pH值测定用酸度计法；有机质测定用水合热重铬酸钾氧化-比法；全氮测定用开氏消煮法；碱解氮测定用碱解扩散法；全磷测定用酸溶-钼锑抗比法；有效磷测定用碳酸氢钠法；全钾测定用氢氧化钠熔融法；速效钾测定用乙酸铵提取法。
--第1期赵雪淞等：人参根际土壤微生物落结构与土壤环境因子的关系
人参皂苷含量测定：取1.2节采集的土壤样本，每个样本称取1g，加入甲醇超声波提取2次，合并提取上清液旋蒸浓缩，然后加入谱级甲醇，过滤定容至1mL后利用UPLC-MS/MS（仪器为岛津8050）的MRM模式进行定量分析。液相条件：流动相A和B分别是酸水（0.1%甲酸）和乙腈；柱箱温度为35℃；谱柱是C18柱（Shim-pack GIST C18，2μm，100×2.1mm），流速为0.2mL·min-1，进样量10μL。采用梯度洗脱的方式，梯度洗脱条件为0~12min，5%~95%B；12~13min，95%B。MS分析条件：采用负离子模式，通过MRM模式对化合物进行检测，接口温度300℃，DL温度250℃，加热块温度450℃，干燥气流量15L·min-1，加热气流量5L·min-1。每个样本3个重复。
磷脂脂肪酸（PLFA）分析：参考TOMOHIRO等[19]的方法优化步骤，称取6g鲜土进行磷脂脂肪酸提取纯化及甲酯化，以十九烷酸甲酯（19:0，10mg·mL-1）为内标，利用气相谱仪GC-2010（岛津）、HP-5MS谱柱（Agi⁃lent，30m×0.25mm×0.25μm）测定样品脂肪酸含量，载气为氮气，以37种脂肪酸甲酯混标(FAME37，47885-U; Supelco)和26种混合细菌酸甲酯（47080-U）为外源标准定性，内标法定量，测定结果用nmol·g-1表示。
PLFA的命名参照FROSTEGARD等[20-22]的方法。细菌（Bacteria，B）生物量通过10:0，11:0，10:02-OH，12:0，14:1，14:0，i15:0，a15:0，15:0，14:02-OH，14:03-OH，i16:0，16:1，16:0，i17:0，17:0，18:0，19:0和20:0脂肪酸含量进行计算，其中，革兰氏阳性细菌（Gram-positive bacteria，GP）以14:0，i15:0，a15:0，15:0，i16:0，i17:0来计算，革兰氏阴性细菌（Gram-negative bacteria，GN）通过10:02-OH，14:1，14:02-OH，14:03-OH，16:1，16:0进行计算。真菌（Fungi，F）生物量用18:2ω9,12，18:1ω9c，18:1ω9t计算。
1.4土壤综合肥力指数（soil integrated fertility index，IFI）计算
用土壤有机质、pH值、土壤全氮和碱解氮、土壤全磷和速效磷、土壤全钾和速效钾作为分肥力指标计算分肥力系数（IFI i），然后利用修正的内梅罗公式[23]来计算土壤综合肥力指数（IFI）。土壤各属性分级标准值参考第二次全国土壤普查标准（表1）。
分级Grades
Xa Xc Xp pH
4.5
6.5
8.5
有机质/(g·kg-1)
Organic matter
10
20
30
全氮/(g·kg-1)
TN
0.75
1.50
2.00
碱解氮/(mg·kg-1)
Alkaline
hydrolyzed nitrogen
60
120
180
全磷/(g·kg-1)
TP
0.4
0.6
1.0
速效磷/(mg·kg-1)
Available
phosphorus
3
10
20
全钾/(g·kg-1)
TK
5
15
25
速效钾/(mg·kg-1)
Available
potassium
40
100
150
表1土壤各属性分级标准值
Table1The grading standards of soil properties
1.5土壤微生物落多样性指数的计算
以PLFA含量为依据计算微生物多样性指数，丰富度指数(R)/S表征物种数，Shannon-Wiener多样性指数(H')表征落中的物种丰富度，H'与Simpson指数(D)共同反映微生物alpha多样性，Pielou均匀度指数(J)是基于H'来计算物种多样性，反映各微生物数目分配的均匀程度，计算公式参考王文铜[24]的研究。
1.6数据处理
利用Excel2013软件进行数据计算，利用SPSS20.0软件进行单因素方差分析（ANOVA），用F统计量进行多因素方差分析，采用最小显著差异法（LSD）进行差异显著性比较，利用Origin2019b绘图，利用Canoco5.0进行冗余分析（RDA）。
2结果与分析
2.1土壤PLFA含量和类型的变化
由表2可知，不同样本检测出的PLFA含量和类型各不相同，在G0、G4、G5、G6土壤样本中分别鉴定出22，18，18，18种PLFA，G0中a15:0含量最高，而G4、G5、G6中19:0含量最高。12:02-OH，14:02-OH，17:0，16:02-OH为G0特有脂肪酸，人参根际土壤中未检出；12:03-OH是G6特有脂肪酸，G0、G4、G5中未检出；11:0是G0、G4、G5共有脂肪酸，G6中未检出；磷脂脂肪酸12:02-OH，14:0，i15:0，a15:0，14:02-OH，16:0，i16:0，16:1ω9c，i17: 0，17:0，16:02-OH，18:0（表征细菌）在G0中的含量显著高于人参根际土壤，而18:2ω9,12，18:1ω9c，18:1ω9t（表
29
--沈阳农业大学学报第54卷
征真菌）在G0中的含量显著低于人参根际土壤（p <0.05）。上述结果说明，人参栽培导致人参根际土壤微生物落组成发生明显变化，栽培年限亦有影响。
序号
No.1234567891011121314151617181920212223
PLFA/（nmol·g -1）11:010:02-OH 12:012:02-OH 12:03-OH 14:0i15:0a15:015:014:02-OH 14:03-OH i16:016:1ω9c 16:0i17:017:016:02-OH 18:2ω9,1218:1ω9c 18:1ω9t 18:019:020:0
G0
0.11±0.01ab 0.13±0.04a 0.29±0.04a 0.14±0.03a
nd 2.00±0.59a 7.94±1.26a 9.12±1.40a 0.97±0.24a 0.29±0.03a 2.79±0.81a 4.07±1.05a 8.28±0.84a 6.35±0.37a 2.31±0.48a 0.87±0.19a 0.38±0.06a 1.15±0.21b 1.43±0.60b 0.92±0.36b 2.78±0.48a 5.48±0.29a 1.01±0.15a G4
0.07±0.02ab 0.07±0.01a 0.17±0.02b
nd nd 0.47±0.18b 2.34±1.25b 2.78±1.47b 0.41±0.15b
nd 0.62±0.25a 1.95±0.94b 1.19±0.57b 3.90±1.71b 1.11±0.48b
nd nd 2.23±0.09a 2.11±0.14b 2.00±0.22b 1.29±0.43b 6.68±1.45a 0.80±0.23a G5
0.13±0.11a 0.10±0.07a 0.21±0.06ab
nd nd 0.79±0.22b 2.60±0.17b 3.50±0.18b 0.53±0.14b
nd 2.62±1.68a 1.68±0.06b 1.97±0.23b 3.30±0.09b 1.13±0.06b
nd nd 2.31±0.07a 2.37±0.80b 2.22±1.04b 1.24±0.10b 7.59±1.64a 0.81±0.10a G6
nd 0.10±0.04a 0.23±0.04ab
nd 0.20±0.11a 1.05±0.41b 2.97±1.01b 4.11±1.44b 0.67±0.25ab
nd 4.80±5.45a 1.98±0.78b 1.98±0.69b 3.97±1.33b 1.23±0.37b
nd nd 2.42±0.13a 5.59±0.55a 4.32±2.49a 1.50±0.63b 6.46±0.59a 0.98±0.26a
微生物类型Microbial type 细菌Bacteria G -细菌Gram-negative bacteria
细菌Bacteria
G -细菌Gram-negative bacteria G -细菌Gram-negative bacteria G +细菌Gram-positive bacteria G +细菌Gram-positive bacteria G +细菌Gram-positive bacteria G +细菌Gram-positive bacteria G -细菌Gram-negative bacteria G -细菌Gram-negative bacteria G +细菌Gram-positive bacteria G -细菌Gram-negative bacteria G -细菌Gram-negative bacteria G +细菌Gram-positive bacteria
细菌Bacteria G -细菌Gram-negative bacteria
真菌Fungi 真菌Fungi 真菌Fungi 细菌Bacteria 细菌Bacteria 细菌Bacteria
表2土壤PLFA 含量和类型
Table 2
Content and type of soil PLFA
注：数据为平均值±标准误差（n =3），不同字母代表处理间差异显著（p <0.05）；nd.未达到检测标准。下同。
Note:Data are mean ±standard error (n =3),and different letters represent significant differences between treatments (p <0.05);nd.Detection criteria not met.The same below.
图1
土壤微生物类PLFA 含量及比值
Figure 1
PLFA content and ratio of soil microbial groups
2.2土壤微生物落结构的变化
不同类型的土壤微生物在环境中有不同生态位，土壤微生物各类PLFAs 含量的变化及其比值可以表征
微生物落结构的变化[25]。由图1可知，人参根际土壤G4、G5、G6的总PLFAs 含量和细菌PLFAs 含量均显著低于G0（p <0.05），而真菌PLFAs 含量与G0相比逐渐上升，G6的真菌PLFAs 含量显著高于其他样本（p <0.05）；G4、G5、G6之间总PLFAs 含量、G +细菌PLFAs 含量和G -细菌PLFAs 含量无显著差异。
P L F A 含量/（n m o l ·g -1）P L F A c o n t e n t s
60
40
20
PLFA 总量PLFA total 细菌Bacteria
真菌Fungi
G +
G -
a
a
b b
b b
b c b b
b a
a
a b
b b b
b b G0G4G5G6
比值R a t i o
2.01.51.00.50
G0G4G5G6
F/B
G +/G -
a
b b
b
a
a
a
a
30
--第1期赵雪淞等：人参根际土壤微生物落结构与土壤环境因子的关系
上述结果说明种植人参降低了根际土壤微生物落总丰度和细菌落丰度。而增加了真菌落丰度；在本研究范围内人参生长年限对其根际土壤微生物落总丰度影响不显著。真菌/细菌（F/B）比值由G0的0.07上升到G6的0.65，二者差异显著，说明长期种植人参使其根际土壤真菌比例增加、其根际土壤微生
物落结构明显改变。各土壤样本间G+菌/G-菌（GP/GN）比值未表现出显著性差异，说明土壤细菌落结构没有显著改变。
2.3土壤微生物落多样性的变化
土壤微生物落多样性反映了土壤微生物落的生态特性，代表了微生物落的稳定性。利用PLFA类型和含量计算土壤微生物落多样性指数，以此说明土壤微生物落多样性的变化。由表3可知，与G0相比，G4、G5、G6丰富度指数下降，多样性指数亦有所下降，G4达显著水平，反映出人参根际土壤微生物落丰度和稳定性降低。与G0相比，G4、G5、G6均匀度指数和优势度指数虽有波动，但未达显著性差异。
数据类型
Data types
人参皂苷含量/（ng·g-1）Ginsenoside content
百分比/%
Ratio
人参皂苷
Ginsenoside
Rb1
Rb2
Rc
Rd
Re
Rg1
G-VXII
F2
人参皂苷总量TG
(Rb1+Rb2+Rc)/TG
(Re+Rg1)/TG
G-VXII/TG
F2/TG
G0
0.04±0.03c
0.04±0.03c
0.04±0.03c
0.05±0.05c
0.01±0.02c
—
—
—
0.19±0.16c
45.00
3.33
—
—
G4
20.47±2.44a
15.75±1.98a
17.03±3.08a
22.41±4.08a
14.81±2.13a
2.44±0.34a
2.83±0.36a
2.15±0.94a
97.88±12.87a
54.38
17.69
2.93
2.17
G5山参
1.25±0.36b
0.44±0.14b
0.48±0.17b
4.69±2.16b
0.29±0.05b
0.08±0.03b
0.32±0.09bc
1.11±0.36ab
8.67±3.24b
26.80
4.75
3.93
13.14
G6
1.97±1.06b
1.09±0.34b
1.23±0.45b
5.13±2.38b
0.83±0.43b
0.29±0.12b
1.11±0.66b
0.71±0.40b
12.36±5.73b
35.12
8.97
8.59
5.57
表4土壤中人参皂苷含量
Table4The content and ratio of ginsenosides in soils
土壤样本Soil sample G0 G4 G5 G6丰富度指数(R)/S
Richness index
22
18
18
18
多样性指数(H')
Shannon-Wiener diversity index
2.628±0.015a
2.448±0.147b
2.57±0.005ab
2.572±0.084ab
均匀度指数(J)
Pielou evenness index
0.838±0.005a
0.831±0.05a
0.873±0.001a
0.882±0.021a
优势度指数(D)
Simpson dominance index
0.909±0.001a
0.87±0.046a
0.901±0.004a
0.899±0.02a
表3土壤微生物落多样性指数
Table3Diversity index of soil microbial community
2.4土壤人参皂苷含量的变化
人参根中皂苷占根干重的3%~7%，目前已从人参根中发现了至少37种天然的人参皂苷单体[26]。人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Rg1和Re是人参根总皂苷的主要成分，含量占总皂苷的90%以上，其中Rb1含量最高，不含有G-VXII和F2[26-27]。前期研究发现，Rb1显著促进人参根部病原菌生长，而人参病原菌能够降解Rb1，降解路径为Rb1→G-XVII/Rd→F2[14]。据此，本研究采用UPLC-MS/MS方法对土壤样本中的人参皂苷单体Rb1、Rb2、Rc、Rd、Rg1、Re以及G-VXII和F2进行定量分析，结果表明（表4），G0中8种人参皂苷单体的含量极低或者未检出，而3种人参根际土壤样本中8种人参皂苷单体均有检出，其中Rd含量均最高；与G4相比，G5和G6中二醇型人参皂苷Rb1、Rb2和Rc的相对含量以及三醇型人参皂苷Rg1和Re的相对含量均下降，而G-VXII和F2的相对含量增加。以上结果表明，人参在生长过程中向土壤中分泌人参皂苷，除Rd外人参根分泌的人参皂苷在土壤中的相对含量随栽培年限的增加而降低，而人参皂苷Rb1的降解产物—人参皂苷G-VXII和F2的相对含量随着栽培年限的增加而增加。前述土壤微生物落组成结构及多样性分析表明，人参根际土壤中真菌落的相对丰度增加，这会增加人参根际土壤中人参皂苷的降解，致使降解产物Rd、G-VXII和F2的相对含量增加。
31

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