乙酸与丙酸比对体外瘤胃液挥发性脂肪酸发酵模式和微生物体多样性的影响
乙酸与丙酸比对体外瘤胃液挥发性脂肪酸发酵模式和微生物体多样性的影响
尹召华;王梦芝;王洪荣;张洁;喻礼怀
【摘 要】本文主要研究乙酸与丙酸比(乙/丙)对体外瘤胃液挥发性脂肪酸发酵模式及微生物体多样性的影响.试验以4头瘤胃瘘管山羊提供瘤胃液,设4个处理,培养底物乙/丙分别为30:70、50:50、70:30和100:0.测定培养液中挥发性脂肪酸的浓度的变化,并通过单链构象多态性(SSCP)图谱检测细菌和原虫的体多样性.结果表明:培养液乙酸浓度以100:0组最高,显著高于其他3组(P＜0.05),50:50组最低；丙酸浓度以30:70组最高,显著高于50:50和70:30组(P＜0.05)；丁酸的浓度30:70组显著高于70:30组(P＜0.05)；各组培养液乙/丙均接近3:1,30:70组显著低于70:30和100:0组(P＜0.05).细菌SSCP图谱显示,50:50组条带数最多,100:0组条带数最少；原虫的SSCP图谱以100:0组条带数最多,30:70组条带数最少.细菌、原虫的SSCP图谱皆以50:50和70:30组图谱间相似性指数为高.总之,乙/丙对培养液挥发性脂肪酸模式、细菌或原虫的体多样性都存在影响.%This paper was conducted to investigate the effects of acetate to propionate ratio on the pattern of volatile fatty acid (VFA) fermentation and diversities of rumen microorganisms. Four goats fitted with permanent ruminal cannulas we
re used to provide rumen fluid for the in vitro study. The four treatments were set according to the acetate to propionate ratio in culture substrates, which were 30:70, 50:0, 70:30, and 100:0, respectively. Variation of VFA concentration was recorded, and diversities of bacteria and protozoa were investigated by SSCP fingerprint technique. The results showed as follows: acetate concentration of 100:0 group was the highest and was significantly higher than that of the other three groups (P < 0. 05) , while that of 50:50 group was the lowest. Propionate concentration of 30:70 group was the highest and was significantly higher than that of groups 50:50 and 70:30 (P <0. 05). Butyrate concentration of 30:70 group was significantly higher than that of 70:30 group (P <0. 05). Acetate to propionate ratios in culture medium of all the treatments were close to 3:1, while that of 30:70 group was significantly lower than that of groups 70:30 and 100:0 ( P <0.05). Bacterial SSCP fingerprint showed that bands number of 50:50 group was the most, while that of 100:0 group was the least; protozoa SSCP fingerprint showed that bands number of 100:0 group was the most, while that of 30:70 group was the least. Similarity index was the highest between 50:50 group and 70:30 group on both bacteria and protoz
oa fingerprints. In conclusion, the VFA pattern and diversities of rumen bacterial or protozoal community can be modified by acetate to propionate ratio in vitro.邮政储蓄银行查询
【期刊名称】《动物营养学报》
河生映画
【年(卷),期】2011(023)012
【总页数】7页(P2129-2135)
【关键词】瘤胃;细菌;原虫;乙酸、丙酸比;多样性
uv是什么【作 者】带狗的成语尹召华;王梦芝;王洪荣;张洁;喻礼怀
【作者单位】扬州大学实验农牧场,扬州225009;扬州大学动物科学与技术学院,扬州225009;扬州大学动物科学与技术学院,扬州225009;扬州大学动物科学与技术学院,扬州225009;扬州大学动物科学与技术学院,扬州225009
【正文语种】中 文
【中图分类】S826
瘤胃微生物在反刍动物消化生理中至关重要。碳水化合物在反刍动物瘤胃中被微生物降解为挥发性脂肪酸(VFA)，VFA可提供机体可消化能的70% ～80%［1］。VFA包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸和己酸等。乙酸、丙酸和丁酸约占瘤胃发酵VFA总产量的95%，也是机体代谢最为重要的几种VFA。丁酸在瘤胃液中含量相对较低(10%左右)，而且可由乙酸转化;乙酸和丙酸是饲料在瘤胃内发酵产生的两大主要有机酸，饲料的种类和微生物的区系不同，发酵产生乙酸与丙酸比(乙/丙)也不同，如非结构性碳水化合物在瘤胃中的发酵率很高，产生VFA总量也较多，但乙/丙较低，而粗饲料则相反。因此，瘤胃液乙/丙可反映饲料在瘤胃中的发酵模式;同时，VFA又为微生物发酵底物和合成微生物蛋白质(MCP)提供能量和碳架。鉴于微生物生长对底物的选择性［1］，乙/丙也会影响微生物蛋白质的合成以及不同区系瘤胃微生物(细菌、原虫等)的体结构，进而影响整个机体的消化与营养代谢［2］。迄今为止，国内外尚未见通过体外培养研究乙/丙影响瘤胃微生物VFA发酵模式以及原虫、细菌体多样性的报道。为此，本研究设置4种乙/丙进行人工模拟瘤胃体外发酵试验，旨在研究瘤胃液乙/丙对微生物发酵模式及体多样性的影响，以期为反刍动物瘤胃微生物营养代谢调控的研究提供基础性资料。
1 材料与方法
林恺俊
1.1 供瘤胃液动物及瘤胃液的采集
试验在扬州大学实验农牧场进行。选用4只健康、体重(37.6 ±1.3)kg、安装有永久性瘤胃瘘管的徐淮山羊羯羊作为瘤胃液供体。单圈饲养，以(玉米+豆粕)∶羊草为30∶70作为饲粮，日给料干物质质量为体重的2%，08:00和20:00分2次等量饲喂，自由饮水。
通过瘤胃瘘管，利用自制真空负压装置，在晨饲前从4头山羊瘤胃内各采约150 mL瘤胃液，过4层纱布，滤液装于预先通有CO2并39℃预热的灭菌生理盐水瓶中，将所有瘤胃液混合均匀，39℃水浴保温送回实验室待用。
1.2 试验设计
试验按培养底物乙/丙不同分为4组，A、B、C和 D 组乙/丙分别为 30∶70、50∶50、70∶30、100∶0，各组能量水平一致。
1.3 体外培养
培养底物配制方法如下:体外培养试验开始前30 min，按表1的体积取乙酸和丙酸溶于20 m
L水中，用1 mol/L NaOH调pH为7.0，再加人工唾液盐(配制参考 Menke等［3］的方法)至80 mL为乙酸、丙酸混合液，39℃水浴待用。
三角瓶经紫外线灭菌30 min后加入1 g酪蛋白;再在各瓶中分别加入按不同比例混合好的乙酸、丙酸混合液80 mL(预先通CO2至饱和、39℃预热);而后加入瘤胃液40 mL;塞好橡皮塞，通CO2、39℃、震荡(50 r/min)培养。每组各设3个重复，另设1个不加底物的(仅含瘤胃液、人工唾液盐)空白对照。体外培养方法参照Menke等［3］的方法进行。
表1 培养底物的组成及能量水平Table 1 Composition and energy levels of cultural substrates项目Items 组别Groups A B C D Acetate/propionate 30∶70 50∶50 70∶30 100∶0原料Ingredients乙酸 Acetate/mL 0.283 0.500 0.744 1.174丙酸 Propionate/mL 0.661 0.500 0.319 0.000酪蛋白 Casein 1.000 1.000 1.000 1.000能量水平Energy levels能值 Energy/kJ 17.86 17.85 17.83 17.80能氮比Energy/nitrogen/(g/MJ)乙/丙8.51 8.52 8.53 8.54
1.4 样品采集
分别在培养后 2、4、6、8、10、12、16 和 24 h 各采集2 mL培养液，并－20℃冷冻保存，
用于培养液VFA浓度的测定。培养结束后，取10 mL培养液分装2个离心管，其中1管用于分离培养液的原虫与细菌，分离后采用二苯胺显法测定细菌、原虫的DNA含量;另1管用于微生物DNA的提取，提取得到的DNA进行体多样性检测。
1.5 VFA 浓度测定
采用日本岛津GC－14B气相谱仪按文献［4］的方法进行测定。
谱条件:毛细管柱CP-WAX(30 m×0.53 mm ×1 μm);气化室 200 ℃，FID 检测器200℃;柱温采用程序升温法，初温100℃，末温150℃，升温速率3℃/min，灵敏度为10，衰减为25;以巴豆酸为内标物。
培养液处理:培养液经15 000×g离心10 min后取上清液1 mL，加0.2 mL 20%含60 mmol/L巴豆酸的偏磷酸，混匀后高速离心取上清液0.4 μL进样分析。
1.6 微生物分离及其DNA浓度测定
培养液微生物采用文献［5］的方法进行分离。1)原虫:取培养液加等体积生理盐水39℃水
浴震荡(125 r/min)培养60 min，并辅以搅拌;再经4层纱布过滤，滤液离心(150×g、10 min)，收集沉淀为原虫，用生理盐水洗涤2次后用生理盐水悬浮，－20℃贮存待测。2)细菌:收集离心后的上清液，再高速离心(15 000×g、15 min)，收集沉淀为细菌，其余处理同原虫。
中国名厨微生物DNA浓度测定采用二苯胺显法、参照赵亚华［6］的步骤。制备小牛胸腺DNA钠盐(上海生工生物工程技术服务有限公司)标准溶液，绘制以DNA浓度为横坐标、吸光度值为纵坐标的标准曲线。取分离后的原虫或细菌样品，调整至线性范围浓度后，2 mL样品加4 mL二苯胺试剂于60℃水浴中保温1 h，使用722N型分光光度计(上海精科)测定OD595 nm。计算公式:

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