高效液相谱法在“青蒿素提取”实验教学中的应用
2020年第24期广东化工
第47卷总第434期www.gdchem · 149 · 高效液相谱法在“青蒿素提取”实验教学中的应用孙忠文，李玉鹏，谢惠定，邱开雄，陈丽君*
(昆明医科大学药学院暨云南省天然药物药理重点实验室，云南昆明650500)
[摘要]为解决“青蒿素提取”系列实验在《有机化学》实验课程中对目标单体化学成分纯度判断不精准、环境污染及安全隐患等问题，加强与培养本科生对现代化仪器的实际操作能力和科研素养，将高效液相谱法应用到“青蒿素提取”系列实验的实验教学中，解决了传统实验教学中薄层谱法和熔点测定法在青蒿素纯度鉴定过程中存在的不足。本文阐述了实验教学中青蒿素纯度鉴定存在的问题，高效液相谱在青蒿素纯度鉴定中引入的必要性，该部分内容在实验课程中的开展模式，以及实验开展前后的相关工作。
[关键词]青蒿素；实验教学；高效液相谱
[中图分类号]G4 [文献标识码]A [文章编号]1007-1865(2020)24-0149-03
Application of High Performance Liquid Chromatography in the Experimental
Teaching of Artemisinin Extraction
Sun Zhongwen, Li Yupeng, Xie Huiding, Qiu Kaixiong, Chen Lijun*
(School of Pharmaceutical Science and Yunnan Key Laboratory of Pharmacology for Natural Products, Kunming Medical University, Kunming
650500, China)
Abstract:In order to solve the problems of inaccurate judgment of the purity of the target monomer chemical composition, environmental pollution and potential safety hazards in the experimental course of “Organic Chemistry” in the series of experiments of artemisinin extraction, strengthen and cultivate undergraduates' practice of modern instruments operating ability and scientific research literacy, applying high performance liquid chromatography (HPLC) method to the experimental teaching of the artemisinin extraction series of experiments, solving the problems of thin layer chromatography (TLC) and melting point determination in the artemisinin purity identification process in traditional experimental teaching of inadequacy. This article describes the problems in the purity identification of artemisinin in experimental teaching, the necessity of introducing HPLC in the purity identification of artemisinin, the development mode of this part in the experimental course, and the related work before and after the experiment.
Keywords: artemisinin；experimental teaching；high performance liquid chromatography
青蒿素的传奇发现及作为抗疟药物的卓越效力和影响力，使其一登上世界舞台就收到了极大关注，其有效性、安全性及廉价性使其成为抗疟疾的一线药物，挽救了数以万计的生命[1]。中国本土女科学家屠呦呦女士，因青蒿素类药物的发现，做出了巨大贡献，并获得诸多荣誉。青蒿素的研发是一场长达13年的艰苦长跑，屠呦呦的贡献是基石、是创新的源头、是从0到1的突破，同时她也认为，协作单位同行们所取得的多方面成果才能成就一个青蒿素，没有大家无私的团队精神，不可能在短期内将青蒿素贡献给世界，团队精神和无私合作加速了科学发现转化成药物[2]。我系老教师也曾参与了该科研成果的研究工作，并结合教学实际，将这一科研成果引入到教学过程中，设计了将萃取、减压蒸馏、薄层层析、柱层析、重结晶、减压过滤及熔点测定七项操作技能组合在一起的，综合性的“青蒿素提取”系列实验，该实验在本校药学、药剂、临床、口腔、医检、法医等各个专业广泛开展[3]。根据多年的实验教学效果和经验，原有实验教材中的内容和方法存在溶剂使用量大、提取时间长、样品损失严重、环境污染、安全隐患等问题，为此笔者前期进行了青蒿素提取系列实验的改进和扩展，从青蒿素的提取、分离纯化、纯度鉴定等几个方面进行了探索，并提出了新的相关实验方案[4]。其中青蒿素的纯度鉴定部分，我们在原有实验基础上删除了熔点测定，导入了高效液相谱。本文将在原有研究基础上，更进一步探讨高效液相谱在“青蒿素提取”系列实验中引入的必要性、如何开展、注意事项。
1 实验教学中青蒿素纯度鉴定的方法和存在的问题
1.1 青蒿素理化性质简介
青蒿素为无针状晶体，分子式C15H22O5，分子量282.34，熔点156~157 ℃，是一种新型倍半萜内酯，具有过氧键和δ-内酯环。其特殊的过氧基团具有热不稳定性，易受湿、热和还原性物质的影响而分解[5-6]，温度超过60 ℃时，分子结构中的过氧键易断裂[7]。
1.2 青蒿素纯度鉴定的方法
房产过户费
现有实验教学中，青蒿素的纯度检测采用薄层层析法和毛细管熔点测定法，实验的方法和步骤以实验教材为准，学生实验结合了教师讲解和学生操作。实验分组为2~3人每组，学生密度大，对样品和仪器的使用率频繁。
1.2.1 薄层层析法
薄层谱法(TLC)是快速分离和定性分析少量物质的一种很重的实验技术，是一种快速、灵敏分离微量物质的谱方法，具有操作方便，设备简单，分离效率高，专属性好，分析速度快，谱参数易调整等特点[8]。取青蒿素粗品、纯品、标准品分别用无水乙醇溶解，精确配置浓度为0.5 %的乙醇溶液。点样于硅胶H板，于展开剂(乙酸乙酯∶石油醚0.50∶2.00)中展开。溶剂挥干后于碘蒸气中显，根据R f值及斑点分布情况，判断青蒿素粗品和纯品的纯度。
1.2.2 毛细管熔点测定法
熔点是指物质由固态转变为液态时的温度，纯物质由固态变为液态是在某一温度完成的，物质熔点通常会产生熔距(熔程)，这与物质纯度有关，纯度越高熔程越短[9]。由于纯净的固体有机化合物一般有固定的熔点，因此可通过熔点测定鉴定青蒿素的纯度。在实验教学中，采用毛细管法对青蒿素进行熔点测定，所用装置包括提勒(Thiele)管、水银温度计和毛细管等。具体实验操作包括毛细管装样、酒精灯加热和读数，至少平行测定两次。
1.2.3 纯度鉴定中存在的问题
薄层谱法除了其优势之外，存在的缺点主要有手动操作比较多，人为的影响因素大，其重现性和精密度有一定的限制。实验探究中发现，经高温加热后的青蒿素理论上分子结构已破坏，但与其标准品进行薄层谱对比分析，发现二者在薄层板上显示的性状和现象无异。实验中所使用的硅胶板，多年来由准备室老师自制，自制的硅胶板受材料和天气的影响，不可控因素较大，且制备好的硅胶板应用效果不太理想。后经协商和调整，硅胶板由试剂公司提供，每块板的规格为3*10 cm。硅胶板使用量较大，且不可回收，实验成本较高。在“青蒿素提取”实验进行之前，已进行了专门的薄层谱分析实验“素的分离”，学生对于薄层谱法的原理、实验过程和步骤、注意事项等，已基本掌握。青蒿素纯度鉴定的实验要求只需定性，即
[收稿日期] 2020-10-26
[基金项目] 云南省应用基础研究-昆明医科大学联合专项(No.2017FE468)；云南省天然药物药理重点实验室开放基金(No.70120020511) [作者简介] 孙忠文(1986-)，男，辽宁营口人，博士，讲师，主要研究方向为化学教育和化合物合成。
*为通讯作者：陈丽君(1984-)，女，云南昆明人，硕士，实验师，从事化学教育和天然产物研究。
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只要依据实验现象和数据，分析实验效果，故青蒿素纯度鉴定中，无需再重复薄层谱的原理及按部就班的实验操作，此部分可以进行小组合并，从而节省实验成本。
毛细管熔点测定法，可培养学生在实验过程中的专注力和操作的细致性。但该法操作复杂，控温不精准，难以清楚地观察样品熔化的过程；青蒿素的熔点为156~157 ℃，由于温度超过60 ℃时，其分子结构中的过氧键容易断裂，因此测定后的样品无回收利用价值，且已进行熔点测定的毛细管无法回收；实验过程中，学生人数较多，盛放青蒿素的试剂瓶活塞开关次数频繁，样品用量大且易潮解；由于生源复杂多样，存在基础和自身的差异，总有学生把老师强调的实验注意事项抛之脑后，水银温度计的使用安全隐患较大，每次进行该部分实验带教老师总是担惊受怕，一旦出现意外，学生对实验的
恐惧心理将会影响到后面一系列实验；石蜡油易被固定在毛细管和温度计之间的橡胶圈污染，由于杂质的影响，反复使用的石蜡油将增大熔点测定误差。
综上所述，青蒿素纯度鉴定在实验教学中存在精密度不稳定、实验成本高、样品浪费、环境污染、干扰学生实验积极性等问题，为克服以上问题，该实验部分需进行变革。因此，我们在青蒿素纯度鉴定的教学实验中引入了高效液相谱法。
2 高效液相谱在青蒿素纯度鉴定中的应用2.1 高效液相谱简介
高效液相谱法也简称为HPLC法，是一种高效、快速、高灵敏度的分离分析方法，在对样品进行分析检测时，不受样品挥发性和热稳定性的限制，特别是大分子、强极性、热稳定性差的化合物[10]。高效液相谱法的优势包含：检测自动化水平高、检测结果准确性高、检测效率高、检测耗时短、灵敏度高；而且谱柱可以反复使用，易回收[11]。相对于薄层谱法而言，高效液相谱法可以更加彻底地分离和鉴定某些有效成分，是一种实用性强，操作简单，灵敏度高，重复性好，应用广泛的一种分析手段[12]。且高效液相谱在实验教学中的应用，尤其是医学院校里教学科研中的应用尤为广泛[13]。
2.2 引入高效液相谱的必要性、可行性
2.2.1 必要性
新形势下高校有机化学实验教学的发展趋势与时代发展要求一致，即朝着更加高效、开放、绿的方向前进。开放、高效、绿的发展趋势能让学生在有机化学实验中树立正确的实验理念，利于其实验能力和良好习惯的培养，与此同时，还能有效降低实验对环境、人类产生的污染和伤害。高校有机化学实验教学的发展还会向着精细、少量化的方向发展[14]。“青蒿素提取”系列实验的纯度鉴定中，因薄层谱法中体现的不足以及熔点测定的弊端，高效液相谱的引入既能克服原有实验的缺陷，又能满足高校有机化学实验教学发展的需求。因此，把高效液相谱应用到“青蒿素提取”系列实验中具有深远的价值和必要性。
2.2.2 可行性
将高校液相谱仪应用到《有机化学》实验教学过程中，既是适应高校实验课程多样化、应用型及实验教学改进的要求，也是适应现代医学高等院校教学的需求，并能与现代企业实践紧密结合起来，使得药学、药剂等专业的学生在进入医药企业实习和未来科研工作中，无论对高效液相谱的理论认知还是实际操作都能提前掌握，以便在未来的工作中奠定基本的科研能力和素养。为此学校近年来采购了多种现代化实验设备，如岛津LC-20AR型高效液相仪及相关配件，这些硬件设施设备的完善，为将高效液相谱技术应用到实验教学中提供了物质基础。在本科生《仪器分析》的理论课程中，详细介绍了包含高效液相在内的相关谱技术，结合电脑软件提供的高效液相相关的视频资源，为实验教学的开展提供了理论基础。课题组前期工作中已摸索了高效液相在青蒿素纯度鉴定中的实验条件，将
实验开展的可行性由理论变为了实际。
2.3 实验如何开展
三本好还是专科好在现有理论基础和物质基础的条件下，开展高效液相谱在青蒿素鉴定中的实验教学，需考虑专业人数及实验条件的局限性。昆明医科大学共开设本科专业33个，学生专业分类按人数计可大专业和小专业。小专业如药学、药剂、临药、卫检、MBBS留学生等，每个年级约在30至120之间，人数较少，课程开展时间统一，实验室资源能够充分供给。大专业包含临床、全科、口腔、麻醉等，人数较多，如临床专业同时开设十多个大班，且班级平均人数较多，有限的分析仪器难以满足学生人数需求。对于学生情况而言，还涉及一部分突发情况下不能如期进行实际实验操作的，2020年疫情下就是活生生的例子。此外，高效液相谱仪数量有限，实验开展以大组形式进行，如果按常规实验每间仪器分析室塞满30多名学生进行课堂教学，所有同学围着一台仪器，很大一部分学生的参与感只是一种形式，教学效果将大打折扣。针对上述情况，如何顺利的开展本实验部分，将根据实际情况，围绕课堂教学、线上教学以及线上线下混合式教学模式进行分析讨论。
属蛇的和什么属相最配2.3.1 课堂教学
按传统的课堂教学，实验可分为三个实验步骤，课前预习、实验操作、完成实验报告。实验课进行之前，理论课教师在课堂上介绍了高效液相谱的原理、配件、应用及注意事项。学生根据实验教材上
提供的内容进行预习，提前了解实验方法和实验步骤。课堂上教师要完成实验原理的讲解、仪器介绍、预习情况检查、实验操作等多项讲解，学生则按照计划好的安排进行实验操作。由于实验时长和高效液相谱仪数量的限制，带教老师进行完整的操作演示后，一个大组的学生只能由1至2名同学做代表进行实验操作。实验结束后学生完成实验报告并由老师进行批阅，整个过程带教老师全程参与。
实验教学的主要教学目标是让学生动手操作，验证与综合应用课堂中学习的理论以及基于理论开展更深的研究，要求理论讲授的内容简短精炼、重点突出[15]。但是，传统的实验课堂教学模式形式单一，方法陈旧，学生的听课质量不高，每一个流程都是被动的按部就班，并且缺少对学生表达力的锻炼和思辨能力的培养，这与教学目标是相冲突的。
2.3.2 线上教学
2020年是非凡的一年，全国乃至全世界爆发了严重的“新型冠状病毒肺炎”疫情。学校是突发公共卫生事件的高发单位，学生是易感染人和防控重点，各高校延迟开学，仅能通过网络形式进行远程授课[16]。不同于理论课程，实验课涉及设备的认知和操作、实验材料的使用和学生协作动手能力的训练等，实验教学该如何开展，这是一个需要解决的问题。而线上教学模式的应用，就是突破时间空间的局限性，充分利用现代模拟和网络技术构建网络虚拟实验室，已成为培养学生能力的有效手段[17]。采用计算机多媒体技术，上传实验教学视频，应用flash 软件开发设计HPLC模拟实验室，导入青蒿素
纯度鉴定内容，实现了有机化学、仪器分析与计算机技术的相互融合，使学生更生动的了解HPLC的内部分离过程及各个因素对实验过程的具体影响，同时通过青蒿素提取系列实验带动了学生的科研兴趣。
2.3.3 线上线下混合式教学
HPLC仪器精密，部件较多，操作需要用心细致和较强的动手能力。传统实验课堂教学以教师为中心，学生实验按部就班，被动的进行机械式操作，缺乏学习和动手的主动性和积极性，对仪器的使用缺乏维护意识。此外，学生人数较多，所有专业的学生同步进行高效液相谱分析实验，仪器分析室和设备数量及师资都是有限的。即便错开时间段，单间实验室学生人数较多，学生信息接收被动，仪器操作不能亲自动手，数据处理流于形式。
虽然虚拟实验有诸多有利因素，但单纯进行线上实验教学也是不妥的。实验操作是训练学生动手能力的一个很好途径，如果完全使用虚拟实验室代替课堂教学实验，学生就没有了动手操作的机会，也违背了培养动手能力的目的。
全校学生由于专业不同，对实验教学的要求也有所不同。如药学、药剂、卫检等小专业的同学，以后的专业涉及天然产物研究和食品药品检验，高效液相的操作是必不可少的，所以这部分同学对高效液相谱的应用不能只局限在理论上，实验操作需列入到实际的课堂实验中。对于这部分有需求的同学，
可提供虚拟仿真实验的资料，提前观看视频内容，对实验的原理和部件、操作步骤进行预习；实验操作进入实验室中进行具体的操作，对预习和操作过程中遇到的问题，及时与带教老师面对面或者其他交流平台进行探讨。整个过程中，学生都是实验的主体，教师只是教学资源的提供者和教学进度的参与者，主要作用是解决学生提出的问题。而专业上对高效液相谱没有需求的同学，可直接提供虚拟仿真实验的线上教学，学生通过视频观摩后与教师进行探讨，这样既减少了实验室设备限制，又减免了仪器损坏的几率，同时可以留更多时间给学生查阅相关文献、思考探索，同时不受时空影响进行学习。可以说线上线下混合式教学弥补了单纯实验课堂教学和线上教学存在的不足。
3 实验开展的准备工作和后续工作
3.1 教学资源的准备
阿兹台克教师在课程开设前需通过网络教学平台为学生提供完善的学习资源；利用网络教学平台、、钉钉、QQ等开展师生互动教学；指导学生利用网络、仿真软件、虚拟实验室等
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辅助工具。对带教老师进行集中培训，对高效液相谱仪的原理、配件、操作及可预见性问题熟悉掌
握。保证高效液相谱仪的正常运行，错开教学与科研使用上的冲突。
3.2 考核机制的完善
混合式的实验教学评价不再是单一的实验报告册，其中综合了课前的线上预习、课堂或虚拟实验操作、课后测评，最后才到实验报告。每个环节都有学生独立进行的过程，同时也有师生之间、同学之间的互动，而且每一环节都需设置独立的评分标准，最后给出的成绩应是综合性的，综合了其中的每一个环节。教研室在实验开展前应制定统一并且完善的考核机制，对学生的实验完成情况给出合理的评价，同时也对带教老师制定考核基准，这样既能检查学生的学习情况，同时也能监管相应的教学效果。
3.3 高效液相谱仪的维护和管理软件实施
高效液相谱仪在使用过程中，经常会出现各种问题和故障，如果使用过程中监管不当或是未能及时处理设备出现的各种故障，那么将进一步影响实验的开展。因此，高效液相谱仪在使用过程中应加强日常的管理维护，提高使用效率，降低维修率，维持精密度，延长使用寿命，为教学和科研做好充分的保障。使用前整理出使用注意事项，使用过程中应做好登记备案记录，仪器须由专人专管，定期做好故障排查和维护保养。
4 结语
本文介绍了实验教学中青蒿素纯度鉴定存在的问题，并探讨了高效液相谱在青蒿素纯度鉴定中引入的必要性，该部分内容在实验课程中的开展模式，以及实验开展前后的相关工作。传统实验教学中，青蒿素的纯度鉴定存在诸多问题，高效液相谱的引入可以为之解决。但高效液相谱在实验教学中存在着一些局限，以什么样的授课模式开展实验，将是解决问题的关键，“线上线下”相结合的混合式实验教学，可以屏蔽时空、学生人数、师资和设备数量受限等诸多问题。由于高效液相谱仪的精贵，日常的管理和维护方能保障实验的正常运行。青蒿素课题是一个热门，“青蒿素提取”系列实验是把科研成果引入到实验教学的一项非常有意义的内容，昆明医科大学多年前已成熟的开展了这一实验，但实验教学过程存在的问题值得我们去正视和探索。
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套生产线停产)的方式，深入学习煤炭气化工艺、粗煤气冷却工艺、煤气净化工艺等内容，该过程由具
有丰富生产经验的企业技术人员和学校授课教师配合讲解，可实现理论指导实践、实践佐证理论的教学目的，有效提升了学生对煤化工技术的深层次认知，增加了学生对煤化工行业的热爱。
4 结论
改革后的《煤化工工艺学》课程，授课教师采取“以学生为中心，教师为引导”的教学理念，多渠道、多方位授课，不仅可提高学生的自主意识，还可有效利用课堂时间，强化学习成效。将实习环节安排在煤化工企业，联合企业专家进行联合授课，使学生对煤化工企业实际情况有更清晰的认识，使其将来更好地为地方经济发展做出贡献。
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