水溶性蚕蛹蛋白功能特性探究
DOI:10.13995/jki.11-1802/ts.024759
引用格式：李丹丹，谢盛莉，马良，等.水溶性蚕蛹蛋白功能特性探究[J].食品与发酵工业,2021,47(4):7-14.LI Dandan,XIE
Shengli,MA Liang,et al.The functional analysis of water-soluble silkworm pupa protein [J].Food and Fermentation Indus-tries,2021,47(4):7-14.
水溶性蚕蛹蛋白功能特性探究
李丹丹1，谢盛莉1，马良1,2，侯勇2，付余1，张宇昊1,2∗
1(西南大学食品科学学院，重庆,400715)2(西南大学前沿交叉学科研究院，生物学研究中心，重庆,400715)摘㊀要㊀以鲜蚕蛹为原料，采用等电点沉淀法提取水溶性蛋白，并对其功能性质进行研究㊂结果表明，蚕蛹水溶性蛋白是一种优质蛋白，必需氨基酸含量占总氨基酸含量的39%㊂蛋白溶解度在70ħ条件下降低程度较小，在pH 4.0~9.0，溶解度因α-螺旋与β-折叠增加呈上升趋势,pH 值>9.0后,β-转角和无规则卷曲含量增加，但蛋白展开程度较小且蛋白之间斥力的增加，溶解度仍随pH 的增加而继续增大，在NaCl 浓度为0.2~1.0mol /L
时，溶解度随着NaCl 浓度增加呈上升趋势,>1.0mol /L 后因盐析作用溶解度下降㊂蛋白乳化性能在油
相体积分数35%㊁蛋白质量浓度1.0g /L ㊁pH 10.0下较好，蛋白起泡性在蛋白质量浓度3.0g /L 下最高，蛋白泡沫稳定性在蛋白质量浓度1.0g /L 下最高，蛋白持油性最大为3.9g /g ㊂该实验结果为蚕蛹水溶性蛋白的综合利用提供理论依据㊂
关键词㊀蚕蛹；水溶性蛋白；功能性质；氨基酸组成；溶解性；乳化性；起泡性
第一作者：硕士研究生(张宇昊教授为通讯作者,E-mail:zhy1203@163)
㊀㊀基金项目: 十三五 国家重点研发计划重点专项(2016YFD0400200)；国家自然科学基金面上项目(31972102)；重庆市基础科学与前沿技术
研究项目(cstc2018jcyjA0939)；中央高校基本科研业务费重点项目(XDJK2019B028)收稿日期:2020-06-15；改回日期:2020-09-08
㊀㊀蚕蛹(silkworm pupa,SP)是蚕蛾科家蚕蛾的蛹，属于蚕茧抽丝后的副产物㊂蚕蛹蛋白是蚕蛹干基中的主要营养物质，据研究,1kg 鲜蛹中蛋白含量相当于0.85kg 瘦猪肉㊁0.96kg 鸡蛋㊁1.09kg 鲫鱼中蛋白含量[1]，可作为一种优质昆虫蛋白源㊂蚕蛹蛋白含有18种氨基酸,8种必需氨基酸含量约40%，符合联合国粮农组织(Food and Agriculture Organization of the United Nations,FAO )和世界卫生组织(World Health Organization,WHO)联合食品标准建议的理想氨基酸模式[2]㊂吕汶骏等[3]采用FMOC-O
PA 柱前衍生化高效液相谱法测定蚕蛹蛋白水解液中的氨基酸,8种必需氨基酸含量达49.09%，高于FAO /WHO 建议的40%；秦伟佳等[4]通过比较提取前后蚕蛹蛋白的氨基酸组成发现，蚕蛹蛋白氨基酸种类丰富，配比合理，符合保健类食品药品要求，有着巨大的发展应用前景㊂
近年来，国内外研究主要集中在蚕蛹水溶性蛋白的提取㊁营养性等方面[5-7]，刘娟[5]采用连续分级提取法从文冠果蛋白中得到清蛋白(水溶性)㊁球蛋白(盐溶性)㊁醇溶蛋白和谷蛋白(碱溶性)㊂练钊[7]采用Osborn 法从缫丝后蚕蛹中提取得到水溶性蛋白,
并对其功能性质进行研究，结果表明蚕蛹中水溶性蛋白的氮溶性指数(nitrigen soluble index,NSI )为97.19%，具有良好的溶解性㊂谢盛莉等[8]研究表明，蚕蛹水溶性蛋白含量较高，过敏原含量极低，有直接开发蛋白产品或者用于食品添加的可能性㊂但关于蚕蛹水溶性蛋白的功能性质的研究，国内外鲜有报道㊂本实验以鲜蚕蛹为原料，对蚕蛹水溶性蛋白的功能性质进行研究，为蚕蛹水溶性蛋白相关食品的开发应用提供理论依据㊂
1㊀材料与方法
1.1㊀材料与试剂
鲜蚕蛹，家蚕实验品种 夏芳 ,25ħ，桑叶饲养，化蛹后第3天放置于-20ħ冻存备用㊂
大豆油(九三牌)，购于重庆市永辉超市，使用时不进行纯化；盐酸，重庆川东化工(集团)有限公司;NaCl，上海易恩化学技术有限公司；十二烷基硫酸钠，美国Bio Basic 公司;8-苯胺-1-萘磺酸,Sigma-Aldrich 公司;30g /100mL 丙烯酰胺工作液(丙烯酰胺29g,
甲叉双丙烯酰胺1g)㊁样品缓冲液(2X)，北京索莱宝科技有限公司;1.5㊁1.0mol /L Tris-HCl，赛国生物科
技有限责任公司；过硫酸铵，广东光华科技股份有限公司；蛋白Marker(10kDa~200kDa),Thermo Fisher 公司；考马斯亮蓝R-250，百奥生物技术有限公司；甲醇，天津市科密欧化学试剂有限公司；冰乙酸，成都市科隆化学品有限公司㊂所有试剂均为分析纯，所有水均为二次蒸馏水㊂
1.2㊀仪器与设备
DGG-9140A电热恒温鼓风干燥箱，上海齐欣科学仪器有限公司;JA3003B电子天平，上海精天电子仪器有限公司;DW-3型数显电动搅拌器，昆山市超声仪器有限公司;HH-4数显恒温搅拌水浴锅，上海新诺仪器设备有限公司;Multifuge X3R高速冷冻离心机，赛默飞世尔科技有限公司;F-380荧光分光光度计，港东科技;L8900全自动氨基酸分析仪，日本日立公司;DSC4000差示扫描量热仪，美国Per-kin Elmer公司;MOS-500圆二谱仪，法国Bio-Log-ic公司㊂
1.3㊀试验方法
1.3.1㊀蚕蛹水溶性蛋白提取
鲜蚕蛹解冻,60ħ干燥，粉碎，脱脂，纯水为溶剂，提取分离，提取液调节pH至等电点，沉淀透析48h后冷冻干燥，得到蚕蛹水溶性蛋白㊂
1.3.2㊀蚕蛹蛋白性质测定
(1)氨基酸分析
参照GB5009.124 2016‘食品中氨基酸的测定“[9]㊂(2)溶解性测定
参照简华君等[10]方法并做适当改动，用蒸馏水配制蛋白质量浓度分别为20㊁100㊁100g/L的蛋白溶液，考察不同温度(20~100ħ)㊁pH(4.0~12.0)㊁NaCl浓度(0.2~1.2mol/L)对溶解性的影响，搅拌溶解30min,5000r/min离心15min，采用双缩脲法测定上清液蛋白浓度㊂
(3)表面疏水性测定
采用8-苯胺-1-萘磺酸(8-anilino-1-naphthalenesul-fonic acid,ANS)作荧光探针的方法测定[11]㊂用浓度
分别是0.2~1.2mol/L的NaCl配制0.1mg/mL的蛋白溶液，并配制10mmol/L的ANS溶液㊂取蛋白溶液2mL，加入10μL的10mmol/L ANS溶液混合均匀，使用荧光分光光度计测定混合液的荧光强度(F1)，同时测定未添加ANS溶液的蛋白样品荧光强度(F0)，设定参数情况为激发波长380nm㊁发射波长490nm㊂(4)乳化性测定
参照PEARCE等[12]的方法，配制1g/L的蛋白溶液，添加不同体积分数的大豆油，使油相体积分数分别为20%㊁25%㊁30%㊁35%㊁40%㊁45%㊁50%,10 000r/min均质1min后立即从底部取50μL乳化液，用1g/L十二烷基硫酸钠溶液稀释100倍后混匀，在500nm处测定吸光度，选择乳化性能较好时的油相
泰安旅游分数作为固定油相体积分数㊂
固定乳化性能较好时的油相体积分数，配制不同质量浓度的蛋白溶液(1.0~9.0g/L)与大豆油混合，根据以上方法，同样选择乳化性能较好时的蛋白浓度作为固定蛋白浓度㊂
同时选择乳化性能较好时的油相体积分数和蛋白浓度配制蛋白溶液，用0.1mol/L HCI或NaOH溶液调整pH值为4.0~10.0，与大豆油混合后测定乳化性能，乳化活性和乳化稳定性计算如公式(1)㊁公式(2)所示㊂
乳化活性/(m2㊃g-1)=
2ˑ2.303ˑA0ˑDF
LˑCˑφˑ10000(1)乳化稳定性/min=
A0
A0-A10ˑ10(2)式中:DF，稀释倍数;L，比池光径,cm;C，蛋白质量浓度,g/mL;φ，油的体积分数;A0,0min时测得稀释后的乳化液吸光值;A10,10min时测得稀释后的乳化液吸光值㊂
(5)起泡性测定
参照王青松等[13]的方法，配制不同质量浓度的蛋白溶液(1.0~9.0g/L)，分别取50mL于100mL 的离心管中，高速涡旋振摇2min后记录体积为V0，放置15min后的体积记为V1，起泡性及泡沫稳定性计算如公式(3)㊁公式(4)所示㊂
起泡性/%=
V0
50ˑ100(3)泡沫稳定性/%=
V1
V0ˑ100(4)式中:V0㊁V1，泡沫体积,mL㊂
(6)持油性测定
参照王青松等[13]的方法，称取0.5g水溶性蛋白(m0)样品，置于50mL离心管中，称重记录为m1，分别将5~25mL大豆油加入到离心管中,50ħ振摇2h,8000r/min离心10min，除去上层油液后称重记录为m2，持油性计算如公式(5)所示㊂
持油性/(g㊃g-1)=
送别 简谱
m2-m1
m0(5)式中:m0㊁m1㊁m2，质量,g㊂
(7)聚丙酰胺凝胶电泳分析
参照杨晖等[14]的方法，制备12%(体积分数)的分离胶,5%的浓缩胶，将不同热处理后的蛋白溶液样品与样品缓冲液(2X)按2ʒ1比例混合，在沸水浴中加热5min，分别取10μL蛋白Marker(10kDa~ 200kDa)
和10μL样品注入上样孔中，电泳初始时设置电流为15mA，待溴酚蓝跑到分离胶中部后，电流调至25mA，当溴酚蓝跑到底部绿胶条下底端时，停止电泳，关闭电源，在培养皿中加入适量的考马斯亮蓝R-250染1h后脱，每30min换一次脱液，直至条带清晰后用凝胶成像系统拍摄电泳图谱后进行分析㊂
(8)差示扫描量热法分析
取10mg的蚕蛹水溶性蛋白固体样品，置于专用铝盒中压片，以空铝盒作对照，使用差示扫描量热仪进行扫描，氮气流速为20mL/min，温度扫描范围为25~150ħ，升温速率为5ħ/min㊂
(9)圆二谱扫描
参照陈雪珂[15]的方法，测定条件：蛋白样品质量浓度为1mg/L，样品槽光径为0.1cm，在190~250 nm扫描，扫描速率1nm/s，响应时间1s，用缓冲液作为空白，累积次数3次㊂图谱分析采用CDPRO软件进行二级结构含量计算㊂
师德师风剖析材料
1.4㊀数据处理
每组数据均重复3次，用SPSS19.0软件对试验数据进行显著性和相关性分析，使用单因素方差分析(ANOVA)方法分析数据,P<0.05表示差异显著，使用Origin9.0软件绘图㊂
2㊀结果与分析
2.1㊀氨基酸分析
㊀㊀如表1所示，天冬氨酸与谷氨酸是蚕蛹水溶性蛋白氨基酸的主要成分，分别占7.09%㊁9.57%㊂蚕蛹水溶性蛋白氨基酸种类齐全，必需氨基酸含量占总氨基酸的含量的39%，苏氨酸㊁缬氨酸㊁蛋氨酸㊁异亮氨酸㊁亮氨酸㊁苯丙氨酸与赖氨酸含量能满足成人需求，其中赖氨酸含量为6.34g/100g，蛋氨酸含量为2.42g/100g，这2种氨基酸分别是谷物蛋白和大豆等油料作物蛋白的限制性氨基酸㊂因此，在日常膳食及产品开发时，可考虑将水溶性蚕蛹蛋白作为蛋白来源或与植物性蛋白复配的成分，补充赖氨酸和蛋氨酸的摄入㊂在非必需氨基酸中，谷氨酸(9.57g/100g)含量最高，其次是天冬氨酸为7.09g/100g㊁组氨酸为5.90g/100g㊁脯氨酸为6.61g/100g㊂水溶性蚕蛹蛋白是一种营养价值较高的蛋白，这将有利于其在食品行业中应用㊂
表1㊀水溶性蛋白氨基酸组成
Table1㊀Amino acid analysis of water-soluble proteins
氨基酸
含量/
[g㊃(100g)-1]比例/%
FAO/WHO成人推荐量/
[g㊃(100g)-1]
天冬氨酸(Asp)7.09ʃ0.059.38ʃ0.01
苏氨酸(Thr)∗  3.28ʃ0.10  4.34ʃ0.160.90
丝氨酸(Ser)  4.04ʃ0.06  5.35ʃ0.04
谷氨酸(Glu)9.57ʃ0.0812.65ʃ0.16
甘氨酸(Gly)  4.28ʃ0.12  5.66ʃ0.13
丙氨酸(Ala)  3.30ʃ0.14  4.36ʃ0.19
半胱氨酸(Cys)0.94ʃ0.07  1.24ʃ0.09
缬氨酸(Val)∗  3.99ʃ0.07  5.28ʃ0.08  1.30
蛋氨酸(Met)∗  2.42ʃ0.08  3.20ʃ0.09  1.70
异亮氨酸(Ile)∗  2.21ʃ0.11  2.92ʃ0.15  1.30
亮氨酸(Leu)∗  4.24ʃ0.12  5.61ʃ0.15  1.90
酪氨酸(Tyr)  1.50ʃ0.09  1.98ʃ0.10
qq邮箱打不开是怎么回事苯丙氨酸(Phe)∗7.05ʃ0.149.33ʃ0.11  1.90
赖氨酸(Lys)∗  6.34ʃ0.068.38ʃ0.08  1.60
组氨酸(His)  5.90ʃ0.177.81ʃ0.22
精氨酸(Arg)  2.85ʃ0.14  3.76ʃ0.16
脯氨酸(Pro)  6.61ʃ0.278.74ʃ0.37
必需氨基酸28.90ʃ0.4039.06ʃ0.27
总量75.60ʃ0.57㊀100.00
九泉何太深
㊀㊀注:∗为必需氨基酸
2.2㊀溶解性测定
2.2.1㊀温度处理对溶解性及蛋白结构的影响
热处理是食品加工过程中常见的加工方式，大部分蛋白在高温热处理会发生不可逆的热变性，从而导致溶解度下降㊂如图1-a所示，蛋白溶解度随温度升高呈先上升后下降趋势，在50ħ时，溶解度达到最大，之后开始缓慢下降，且温度大于80ħ之后显著下降，结合图1-b，在20~50ħ，电泳条带相差不大, 60ħ后水溶性蛋白的两个主要电泳条带逐渐变浅, 100ħ时蛋白条带已经很浅，表明蛋白亚基被严重破坏，发生变性聚沉㊂采用差示扫描量热法对水溶性蚕蛹蛋白进行分析，在热分析图谱上出现吸热峰表示该点已处在蛋白质热变性温度区域，并且这个峰值对应的温度即为该样品的热变性温度[16-17]㊂如图1-d所示，蚕蛹水溶性蛋白主要发生了3次热变性，蚕蛹水溶性蛋白第1次热变性的起始变性温度为70ħ左右，峰值变性温度为76.8ħ，结束变性温度为80ħ左右，直观图观察显示此时玻璃瓶中蛋白溶液出现明显沉淀；第2次热变性的起始变性温度为100ħ，峰值变性温度为104.2ħ，结束变性温度为110ħ，这个峰的出现可能与蛋白中含有的结合水有关；第3次热变性的起始变性温度为115ħ，峰值变性温度为122.3ħ，结束变性温度为140ħ，这个峰相比于前
两个峰宽更明显，可能与100ħ电泳条带中的剩余的少量亚基有关㊂蚕蛹水溶性蛋白可以耐受70ħ,30min 的热杀菌㊂因此在蛋白加工过程中，可对含有蚕
蛹水溶性蛋白液体制品采用巴氏杀菌，提高产品的微生物安全性㊂
a -不同温度溶解性变化;
b -蛋白亚基的变化;
c -溶液外观变化;
d -差示扫描量热法扫描图
图1㊀温度对水溶性蚕蛹蛋白溶解度的影响
Fig.1㊀Effect of temperature on solubility
注：不同字母间表示差异显著(P <0.05)(下同)
2.2.2㊀pH 对溶解性及蛋白结构的影响
蛋白的溶解性与蛋白质的生理功能有关㊂如图
2所示，在pH 4.0~12.0，随着pH 的增加，溶解度呈显著上升趋势(P <0.05)㊂谢盛莉等[8]研究结果显示蚕蛹水溶性蛋白的等电点为3.8,pH 大于等电点,pH 越高，蛋白质带有的负电越多，其静电排斥力和离子水化作用增加，导致蛋白质分子之间不易
发生聚集，从而增加了蛋白质的溶解度[18]㊂因此，蚕蛹水溶
性蛋白更适合在中性或弱碱性的条件下使用㊂图2㊀不同pH 下溶解度的变化Fig.2㊀Solubility at different pH
蛋白质的二级结构可以通过圆二谱(circular dichroism,CD)数据反映，一般蛋白质的CD 光谱含有
1个正峰(190nm)和1个负槽(205~235nm)，其中，主链构象与负槽的形状密切相关㊂α-螺旋结构在靠近192nm 有1个正的谱带，在222nm 和208nm 处有2个负的峰谱带;β折叠在216nm 附近有1个负谱带，在185~200nm 有1个正谱带,β转角在206nm 附近有1个正谱带[19]㊂如图3-a 所示，水溶性蛋白的CD 谱图在220nm 附近有强负吸收峰，是α螺旋的特征峰[20]㊂由图3-b 可知，在pH 4.0~9.0，随着pH 的增大,α-螺旋与β-折叠含量也逐渐增大,β-转角和无规则状态含量随着pH 的增大而减少，表明水溶性蛋白二级结构之间的有序结构增多㊂这一变化现象与蛋白的溶解度随着pH 的变化相一致,pH 的增大促进了蛋白质溶解度的增加[20]，蛋白质之间的空间距离也相应增大，暴露出较多的α螺旋结构㊂pH 9.0后,α-螺旋与β-折叠总含量出现下降趋势，可能是在较强的碱性作用下维持这些结构的氢键及疏
水作用力等部分被破坏，蛋白质有序度降低造成的㊂β-转角和无规则卷曲含量增多，蛋白展开程度较小且蛋白间的斥力增加，蛋白溶解度保持上升趋势㊂
a-水溶性蛋白在不同pH下的圆二谱图;
b-不同pH下蛋白二级结构的相对含量
图3㊀不同pH下的圆二谱图
Fig.3㊀Circular dichromatograms at different pH 2.2.3㊀NaCl浓度对溶解性及蛋白疏水性的影响
由图4-a可知，随着NaCl浓度的增大，在0.2~ 1.0mol/L内溶解度呈显著上升趋势(P<0.05)，造成这一现象原因是随着盐浓度的增加，盐类解离出来的离子与蛋白的解离基团离子相互作用增强，表面游离疏水基团减少，亲水性基团暴露增多，导致蛋白溶解度增大；但NaCl浓度过大(超过1.0mol/L)，溶解度显著下降，盐离子解离出的离子与水分子结合，降低了蛋白与水分子之间的作用力，亲水基团暴露较少，亲水性减弱，导致溶解度下降[5]㊂
蛋白质的表面疏水性与蛋白分子的内部结构㊁外界环境有很大关系[21]㊂在0.2~1.0mol/L盐浓度内，随着NaCl浓度的增加，蚕蛹水溶性蛋白疏水值呈显著下降趋势，这一现象的原因是盐离子与蛋白的解离基团离子相互作用增强，导致表面游离疏水基团减少，疏水性下降㊂NaCl浓度大于1.0 mol/L时，疏水值呈显著上升趋势，盐离子解离出的离子不仅与蛋白的解离基团离子结合，还可以与水分子结合，使蛋白分子间的相互作用增大，亲水性减弱，疏水性增强[5]㊂因此，在进行盐溶性蛋白的溶解时
，盐浓度应不超过1.0mol/L，防止盐析现象的出现㊂
a-溶解性;b-疏水性
图4㊀不同盐浓度下溶解度与表面疏水性变化Fig.4㊀Changes in solubility and surface hydrophobicity at企业管理规章制度
different salt concentrations
2.3㊀乳化性测定
2.3.1㊀油相体积分数对乳化性影响
乳化活性和乳化稳定性是评价蛋白质乳化性能的常用指标，与蛋白质分子的两亲结构㊁溶解度等因素有关[5,21]㊂如图5所示，在油相体积分数为20% ~35%，乳化活性随油相体积增加呈显著上升趋势，可能是随着油相体积分数的增加，形成的界面面积增大，蛋白分子暴露的基团更易吸附在油水界面，界面上蛋白吸附量增多造成的[21]；油相体积分数为35%达到最大，表明蛋白乳化的油量最多；油相体积分数大于35%后乳化活性降低，可能是油相比例过大，体系中油滴之间的聚集增强[5]，破坏了油水界面的相互作用，界面蛋白吸附数量减少，乳化活性降低㊂乳化稳定性在油相体积分数20%时达到最大，之后乳化稳定性随油相体积分数的增加有不同程度的下降，油相体积分数的增加使油滴之间的
聚集增强，破坏了油水界面的相互作用，界面上蛋白的吸附强度降低，稳定的乳化状态会受到破坏㊂考虑到较好的乳化活性与稳定性，可选择35%作为固定油相体积分数㊂2.3.2㊀蛋白浓度对乳化性的影响
蛋白浓度对乳化性有直接影响，如图6所示，在油相体积分数一定的情况下，蛋白质量浓度由1.0g/L 上升到9.0g/L时，乳化活性呈下降趋势(P< 0.05)，蛋白质量浓度超过5.0g/L时，乳化活性增幅不明显㊂蛋白溶解度的增大引起蛋白浓度升高，溶解度与蛋白质表面电荷数有关[22],，不

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