62EB病毒(EBV)核酸检测标准操作规程(荧光PCR法)
汽车必买保险>劳动节手抄报内容大全EB病毒(EBV)核酸检测标准操作规程
(荧光PCR法)
1.目的
规范EB病毒核酸DNA(荧光PCR法)检测操作流程,准确进行EB病毒DNA分析。
2.应用范围
使用中山大学达安基因股份有限公司EB病毒核酸扩增(PCR)荧光定量检测试剂盒(荧光PCR法)和Mx3000P荧光定量PCR仪、Roche480荧光定量PCR仪进行EB病毒DNA检测。
变频器接线图3.职责
由PCR实验室制定程序文件,专业技术人员负责执行,实验室主管负责监督实施。
4.内容
4.1 实验原理及其临床应用
    本试剂盒用一对EB病毒(EBV)特异性引物和一条EB病毒(EBV)特异性荧光探针,配以PCR反应液、耐热DNA聚合酶(Taq酶)、核苷酸单体(dNTPs)等成分,用PCR体外扩增法检测EB病毒(EBV)DNA。用于人血中EB病毒DNA的测定,为临床提供参考,
4.2 标本采集
4.2.1 使用标本类型:全血。
4.2.2 标本采集;由合作单位按照以下要求进行采集。
4.2.2.1全血:用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升,注入EDTA(乙二胺四乙酸二钠)或枸橼酸钠抗凝剂的玻璃管,立即轻轻颠倒玻璃管混合5-10次,使抗凝剂与静脉血充分混匀,密闭送检。
4.2.3 标本保存和运送:标本可立即用于测试,也可以保存于-20℃待测,保存期为6个月。标本运送采用0℃冰壶。
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4.3 试剂准备
4.3.1 供应商:中山大学达安基因股份有限公司
4.3.2 此实验试剂应放在冰箱-20℃保存,在实验前5分钟取出备用,实验后应立即放回冰箱-20℃。
4.3.3 如果试剂出现了封口蜡破损导致液体外漏以及过期试剂,应及时更换。
4.4 质控品
4.4.1 质控品来源:随试剂盒,由厂家提供。
4.4.2 质控品保存条件:置于-20℃冰箱中保存。
4.4.3 质控频度:每次实验均需做质控。
4.5 操作过程说明
4.5.1 DNA提取
4.5.1.1 质控品处理:取出阴性质控品、临界阳性质控品、强阳性质控品。8000rpm离心数
秒,吸50ul至0.5ml灭菌离心管中,加入50ulDNA提取液充分混匀,100℃恒温处理10±1分钟;12000 rpm离心5分钟,备用。
4.5.1.2 样本处理
4.5.1.2.1 取全血500ul至干燥玻璃试管中,加入生理盐水500ul轻摇混匀;
4.5.1.2.2 取干燥玻璃试管加入1ml淋巴细胞分离液;
4.5.1.2.3 将稀释好的全血用移液器缓慢加入加有淋巴细胞分离液的试管中(注意沿着管壁,速度要慢);
4.5.1.2.4 2000rpm离心20分钟(建议用水平离心机);
4.5.1.2.5 吸取白细胞层(从上往下第二层),加入1.5ml离心管,12000rpm离心5分钟;
4.5.1.2.6 去上清,沉淀中加入50ulDNA提取液充分混匀,100℃恒温处理10±1分钟;  12000rpm离心5分钟,上清备用。
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4.5.2.1 加样:取PCR反应管若干,加入处理后的样品(标本、阴性质控品、临界或强阳性质控品)上清液5ul,8000rpm离心数秒,放入仪器样品槽。
4.5.3 PCR扩增
      将准备好的PCR反应管放置于PCR仪上,编辑样本信息并按下列循环参数进行扩增反应:37℃-2min;94℃-2min;(94℃-15ses;55℃-45ses)×40 cyclics;
      EBV检测荧光素:FAM;  反应体系:50ul; 荧光信号收集:55℃-45ses,末端收集。
4.5.3  Mx3000P荧光定量PCR仪的设置及结果分析
4.5.3.1 打开计算机电源。
4.5.3.2 将Mx3000P电源开关打开,在大约1分钟的时间内,仪器将会自检并且能听到滤镜轮转动的声音。打开电脑上的Mx3000P软件,确定软件界面右下面的联机标志呈现绿。如果不是绿而是红,软件会提示,这时只需要继续稍等片刻,待仪器自检完成,会自动连接计算机。
4.5.3.3 在软件的弹出框中选择您要进行的实验类型,通常选择第一项“Quantitive PCR(Multiple Standards)”进行绝对定量分析。
4.5.3.4 确定卤钨灯已经打开。(绿)则说明卤钨灯已经打开;(黄)则说明卤钨灯正在预热;(红)则说明卤钨灯没有被打开,这时需要用鼠标点击这个标志将光源打开。在卤钨灯已经被打开的情况下,软件界面右下方会显示(绿)。
4.5.3.5 最好在仪器与光源预热20分钟后开始实验。
4.5.3.6 在里,对所选孔进行设定,在Well type中设定Standard(标准 品)、NTC(阴性对照)、unkown(样品)等,并选择正确的荧光通道(FAM, HEX, ROX,Cy5),参比荧光(Reference dye)选None。对于标准品,在Well type中设定为“Standard”后,再设定其模板浓度。方法为:点击 ,10倍的浓度梯度可以直接点击,在下拉菜单中选择不同的
系数关系后,依次点击设定为标准品的另外几个孔,浓度将实时显示。也可以直接点击标准品的各个孔位, 在一栏,手工输入浓度。若要对不同的样品进行编号,则双击所选孔,在name框中输入样品号,点击就能显示样品编号。或者点击版面右上方的,导入以前使用的96孔板设定。
4.5.3.7 点击,进行PCR循环的设定,可以直接点击温度、时间改变各项温度、时间、循环数等。在选定大步骤之后添加步骤可选定该大步骤后,点击,或点击鼠标右键,在弹出的对话框中,选择Add Segment,则可在该大步骤之后添加一个大步骤;若是在选定大步骤里面的小步骤后边添加一小步骤,选中该小步骤,点击鼠标右键,在弹出的对话框中选择“Add Plateau with Ramp”。
要删除某个大步骤,直接选定大步骤,点击界面右边的“”,或者点击鼠标右键选Delete,即可删除该步骤。如果要删除一个大步骤里的小步骤,可先选定此步骤时间和温度中间的横线,将其变红,如图,点击界面右边的“”,或者点击鼠标右键选Delete,即可删除该步骤。点击,导入以前设定的PCR程序。
(END)代表在这一步结束时采集荧光信号;(ALL)代表在这一步的全过程都采集荧光
信号,一般用作熔解曲线分析。可直接用鼠标将此图标拖到要采集信号的地方。若要去除,可将其拖出循环设定区域。
4.5.3.8 结束之后,点击软件界面右上方的。会弹出对话框提示:仪器灯源正在预热,需要“马上运行”或者是“灯预热完成后再运行”?通常可直接点击“马上运行”,但最好点击“灯预热完成后再运行”,可以保护灯源。
软件界面右下方会出现运行状态显示框Run Status,点击Start开始实验。在运行过程中可以通过点击Add Cycles来增加扩增的循环数。还可以选择勾选“Turn lamp off at end of run”,在PCR运行结束之后软件将自动关闭卤钨灯。
4.5.3.9 在PCR运行的过程中可以点击,观察样品的实时扩增原始结果。
4.5.3.10  PCR运行结束后,点击,再点击Results,软件将自动进行结果分析,也可点击手动进行结果分析。可以手动调节阈值线(拖动)进行分析。点击可显示标准曲线,看斜率、截距、线性相关是否在可控范围内。左下角的可选择相应的荧光观察扩增曲线。右边的可根据自己的需要选择显示的界面。是扩增曲线,Ct值列表,标准曲线,样本起始浓度,
结果excel表格输出,合并面板,包括设置、程序设定、样本Ct值、扩增曲线四个面板。
4.5.3.11 分析曲线时,如果曲线不够光滑,还能用中的Smoothing对曲线进行调节,一般Amplification average是3,可按需要将其调至较大数值,如5、7、9,调整后曲线将更光滑,不过Ct值会稍微靠后一点,使数据失真,通常情况下,不建议这么做。
4.5.3.12 如果需要对每条曲线进行单独的基线设置,点击中的Baseline Correction,点击Adaptive baseline,在下面对应的各孔,单独进行基线起始和终止位置的调节。
4.5.3.13 关于Mx3000P调用前一次实验标准曲线的补充说明。点击桌面Mx3000P的软件图标,弹出话框:选择Multiple Experiment Analysis (多项实验结果分析)选项,点击“OK”,出现如下对话框,建议选择“Use common threshold”进行分析进算,然后点击,导入需要一起分析的上机文件,点击“Finish”即可。
4.5.3.14 这里选择时要注意:1.两个或者多个实验结果要有相同的实验程序 ;2.每次程序中的循环数应该一致。在分析栏可以选择不同实验的不同反应孔进行同步分析。
4.5.3.15 分析质控结果:
阴性质控品:EBV(FAM)Ct值= 40或“No Ct”。
阳性质控品:EBV(FAM)Ct值<33,且有较好的对数增长曲线。
以上要求需在同一次实验中同时满足,否则本次实验无效,需重新检测。
4.5.3.16 记录实验数据。
4.5.3.17 取出结束后扩增仪内扩增产物需用一次性手套包好、封口后,丢入医疗废物垃圾桶内,以防止扩增管破裂而导致污染。
4.5.4 Roche480荧光定量PCR仪的设置及结果分析
4.5.4.1 先打开电脑,再打开荧光定量PCR仪器,然后双击图标“”,打开仪器数据库。
4.5.4.2 双击图标“”,启动罗氏480软件。
4.5.4.3 在弹出的对话框中,输入用户名和密码,进入软件设置界面。
4.5.4.4 在弹出的界面中,点击“”,进入新的实验设置界面:
4.5.4.5 在“”菜单栏里,“”子菜单下。
4.5.4.6 将“Detection Format”选择为Daul或3 color的探针杂交类型。
4.5.4.7 将“Reaction Volume”设置为“50ul”。
4.5.4.8 在“Programs”下:通过“”“”来增加总的循环阶段及阶段的循环数,并在“变性→延伸→退火”循环阶段的“Analysis Mode”下选择Quantification。
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