荧光实时定量PCR法检测流感病毒核酸的质控结果
32Clinical Research, Oct. 2020, Vol. 28, No. 10
作者简介：杨舒雯(1985—)，女，汉族，河南郸城人，主管检验师，本科。研究方向：微生物检验方面。·论著·
荧光实时定量PCR法检测流感病毒核酸的质控结果
杨舒雯
郑州二本大学
炒菜用什么锅好(河南省周口市疾病预防控制中心 微生物检验科，河南 周口 466000)
摘要：目的 观察流感病毒进行荧光实时定量PCR法核酸检测的质控结果。方法 临床选择2017年5月—2019年11月在河南省周口市疾病预防控制中心诊治的流感病毒患者120例，对流感病毒核酸RNA进行提取，应用PCR实时荧光定量进行检测，评估PCR检测的质控结果。结果 PCR实时荧光定量检测法检测流感病毒乙型44例，甲1型40例，甲3型36例，按照分子生物考核操作标准评估，检测核酸结果均合格，合格率100.0%。结论 流感病毒核酸检测应用PCR实时荧光定量检测法的检测数据准确、快速，可作为突发性公共卫生事件首选检测方法。
尼采名言关键词：质量控制；核酸检测；流感病毒；PCR实时荧光定量
中图分类号：R44文献标志码：A 文章编号：2096―1278(2020)10―0032―02
流感病毒是导致流行性感冒的病原体，可分为甲、乙、丙三型，属于正粘病毒科，其中甲型流感病毒可导致大流行性流感[1]。临床可出现呼吸道临床特征、乏力、肌肉酸痛、高热等，具有迅速传播、潜伏期较短、传染性较强等特征，为控制流感病毒的蔓延速度，临床需研发快速检测方式。研究发现，PCR实时定量荧光检测法可在电脑软件的操作下完成，避免了传统PCR法的污染性、特异性较低等问题，荧光信号强度在每次循环中均可得到检测，PCR实时定量荧光检测法在检测食品安全、动物疫病毒、临床诊断疾病中起到关键性作用[2]。本研究选择2017年5月—2019年11月在河南省周口市疾病预防控制中心诊治的流感病毒患者120例，应用PCR实时荧光定量检测，评估PCR检测的质控结果，现报道如下。
1 资料和方法志愿怎么填报
1.1 一般资料
临床选择2017年5月—2019年11月在本院诊治的流感病毒患者120例，其中男性72例，女性48例；年龄12～78岁，平均年龄(54.6±3.1)岁；流感病毒分型：乙型44例，甲1型40例，甲3型36例。纳入标准：患者符合中华人民共和国卫生部制定的流行性感冒诊断标准(WS285-2008)的诊断标准[3]；患者经临床实验室检查、影像学检查、临床症状确诊；患者均为首次发病。排除标准：妊娠期、哺乳期女性；2周内应用抗病毒药物者；肝肾功能异常者；标本采集后污染者。本院医学伦理委员会审批通过本研究，全部研究对象签署知情同意书。建筑安装工程承包合同
1.2 方法
标本采集：采集时间需在发病早期1～3日内，越早越好。采集标本：咽喉洗漱法，采集时先让患者咳嗽，应用10 mL收集液反复洗漱咽喉部约1 min，吐入管内；标本采集后至冰壶(4℃)内即刻送至实验室。标本处理：毛细吸管反复挤压咽拭子，打散黏液，在4 ℃下静置5～10 min，自然沉淀后取上清液3 mL，根据每毫升加入链霉素1 000 μg、青霉素1 000单位，混匀置4 ℃处理2～4 h可接种。
①核酸RNA提取：离心管(1.5 mL)内加入100 μL 流光病毒培养液、500 μL流光病毒裂解液，充分混匀后加入600 μL 70%乙醇溶液，将RNA提取柱取出，加入混合液600 μL，离心机进行15 s冷冻离心处理，离心速率为12 000 rpm，将收集管液体除去，冷冻离心处理15 s，离心速率为12 000 rpm，RNA提取柱移取至无污染收集管，混入700 μL RW1，离心处理15 s，离心速率为12 000 rpm，RNA提取柱移取至无污染收集管，混入500 μL RPE清洗液，离心处理3 min，离心速率为13 000 rpm，提取柱取出，移取至无污染收集管内(1.5 mL规格)，将50 μL无核糖核酸酶水混入提取柱内，在20 ℃环境下置放2 min，离心处理60 s，离心速率为12 000 rpm，提取柱除去，获得流感病毒核酸RNA，置存于20 ℃环境内。
大笑江湖片尾曲②扩增：样本5 μL、混合酶1 μL、混合液19 μL处理，反应体系25 μL，VIC荧光通路检测甲1型流感病毒核酸；样本5 μL、混合酶1 μL、混合液19 μL处理，反应体系25 μL，FAM荧光通路检测甲3型流
感病毒核酸；样本5 μL、混合酶1 μL、混合液19 μL处理，反应体系25 μL，FAM荧光通路检测流感病乙型流感病毒核酸。PCR实时定量扩增反应条件为：45 ℃ 10 min，95 ℃ 15 min，60 ℃ 1 min，扩增共50次反复循环，按照基线选择荧光信号值3～15个循环；严格根据PCR实时荧光定量检测操作流程、分子生物考核操作标准操作试验，评估PCR检测的质控结果。
1.3 仪器与试剂
德国 Hettich ROTINA420R离心机，Line Gene mini PCR实时荧光定量分析仪，北京赛诺利康生物技术有限公司提供的乙型、甲3型、甲1型流感病毒PCR荧光检测试剂盒，生产批号：20071201。RNeasy  miniKit(RNA 提取液)由德国Qiagen公司提供，货号：74104。 
1.4 结果评估标准
结果阳性[4]：Ct阈值＜40；结果阴性：Ct值无数值样本为阴性样本，Ct值＞40.0的样本建议重做，此次试验视为无效。
分子生物考核标准：仪器检测通道选择F1通道，读取F1通道的检测结果，阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，结果显示阴性为准。若阴性对照出现扩增，可以考虑由于环境污染而造成的假阳性。此时应设立空白对照检测。若出现阳性则说明发生环境污染，此时应对室内
进行通风、擦洗工作台及实验用品，并对实验用离心管、吸头重新高压灭菌，更换所有试剂。阳性对照Ct值＞40，则需考虑RNA降解，此时应对试验

版权声明：本站内容均来自互联网，仅供演示用，请勿用于商业和其他非法用途。如果侵犯了您的权益请与我们联系QQ:729038198，我们将在24小时内删除。