＊为通讯作者。
基金项目：贵州省农业攻关项目“牛结核病ＰＣＲ诊断试剂盒的研制与应用”〔黔科合ＮＹ（２００９）３０８６〕；贵州省畜禽健康养殖技术创新能力建设项目〔黔科合院所创能（２０１０）４００４〕；中央补助地方科技基础条件专项基金项目〔黔科条中补地（２０１０）４００１
〕。应用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）
技术检测牛结核病吴位珩１ 孙启跃１ 徐景峨１ 杨 莉１ 廖 梅２ 史开志１ 杨茂生１＊
（１贵州省畜牧兽医研究所 贵州贵阳 ５５０００５ ２贵州省农业厅冻精站 贵州贵阳 ５５０００５）
【
德国二战电影大全摘要】本试验应用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）技术原理，研究建立了牛结核病ＰＣＲ检测方法。试验结果表明：该方法的敏感性测定模板浓度为３０．４ｐｇ，特异性测定牛结核分枝杆菌在４７８ｂｐ出现特异扩增带。通过对２９８头份牛奶和２２９份牛全血样本进行检测，检出阳性牛奶样本３３份，阳性全血样本４３份；鲜牛奶样本同时还用罗氏培养后采取ＰＣＲ方法进行检测，检出阳性样本３４份；全血样本同时还用ＰＰＤ进行皮内试验，检出阳性样本５２份。试验表明：牛结核病ＰＣＲ
检测方法具有敏感性高、特异性强、快速等优点，为牛结核病的早期诊断提供了科学依据。
关键词：聚合酶链式反应；牛结核病；诊断 牛结核病是一种人畜共患的慢性传染病，
主要由牛分枝杆菌引起。潜伏期为１５～４５ｄ，有的更长，常取慢性经过，病初症状不明显，病后期有间歇热和弛张热，急性常有稽留热。据统计，建国以来共计发病牛１４６ １５１头，死亡１１ ５７３头，处理阳性牛２４ ０６８头，给我国的养牛业带来巨大损失。要消灭和控制牛结核病关键是要对该病进行诊断，
传统的牛结核分枝杆菌检测方法主要是表型分类法，耗用时间比较长，一般１～２个月，
而常规的结核菌素皮内反应检测方法，不断有报道存在非特异性反应。ＰＣＲ技术因具有快速、特异和敏感等优点已广泛应用于临床标本的检测中。本研究根据牛结核分枝杆菌复合物的插入序列ＩＳ６１１０的基因序列设计引物，建立了快速、敏感、特异的诊断牛结核病的ＰＣＲ检测方法，并应用于奶牛奶样标本及全血样本的检测中，为牛结核病的流行病学调查及该病的诊断提供了实用技术。
１ 材料与方法１．１ 参考菌株
牛分枝杆菌参考菌株〔
编号为９３００６（４）〕、胸膜肺炎放线杆菌、大肠杆菌、魏氏梭菌购自北京药品生物制品检定所。巴氏杆菌、沙门氏菌、金葡萄球菌、链球菌由贵州省畜牧兽医研究所畜禽疫病研究室分离鉴定。
１．２ 主要试剂
１．２．１ 引物：根据牛结核分枝杆菌复合物的插入序列ＩＳ６１１０的基因序列设计引物，序列号为：〔Ｘ５７８３５．２〕，其理论跨幅约４７８ｂｐ
。引物序列如下：上引物５′－ＧＡＴＧＧＣＧＡＡＣＴＣＡＡＧＧＡＧＣＡＣＡ－３′下引物５′－ＡＣＴＧＡＧＡＴＣＣＣＣＴＡＴＣＣＧＴＡＴＧＧＴ－３′由上海捷瑞生物工程有限公司合成。
１．２．２ 主要试剂：ＴＥ缓冲溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１ｍＭＥＤＴＡ）、蛋白酶Ｋ（浓度１０ｍｇ
／ｍｌ，用ＴＥ溶液配制）、裂解液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，２．５ＭＮａＣｌ，５％ＳＤＳ）、琼脂糖、无水乙醇、７０％乙醇、３．８％的柠檬酸钠、１×ＴＢＥ电泳缓液、溴化乙锭（ＥＢ）或Ｇｏｌｄｖｉｅｗ核酸染料均由项目组配制，Ｍａｒｋｅｒ ＤＬ２０００、２×Ｔａｑ ＰＣＲ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０５ＵＰｏｙｍｅｒａｓｅ／μｌ）购自天根生化科技〔北京〕有限公司，改良罗氏培养基由贵州省防疫站结核病研究所惠赠。
１．２．３ 样本的采集：（１）鲜奶样本：无菌采集奶牛场Ａ鲜奶１０２份，奶牛场Ｂ鲜奶２６份，奶牛场Ｃ鲜奶７２份，奶牛场Ｄ鲜奶９８份，共计２９８份。（２）全血样本：用ＥＤＴＡ作为抗凝剂无菌采集奶牛场Ⅰ全血３０份，奶牛场Ⅱ全血３９份，奶牛场Ⅲ全血９８份，某种畜场种牛全血６２份，共计２２９份，－２０℃保存备用。
１．３ 模板的提取
１．３．１ 牛分枝杆菌核酸提取：将牛分枝杆菌接种于改良罗氏培养基上，３７℃培养约１５～３０ｄ，收集菌体于１．５ｍｌ离心管中，加入ＴＥ缓冲溶液２００μｌ，蛋白酶Ｋ ４０μｌ，裂解液１６０μｌ，充分混匀，６０℃水浴作用１５～２０ｍｉｎ，加入无水乙醇２００μｌ，采用吸附柱收集ＤＮＡ模板，清洗剂为７０％的乙醇。对照菌株胸膜肺炎放线杆菌、大肠杆菌、魏氏梭菌、巴氏杆菌、沙门氏菌、金葡萄球菌、链球菌ＤＮＡ模板的提取方法与牛分枝杆菌ＤＮＡ模板的提取方法相同。
１．３．２ 样本模板的提取：取牛奶（或全血）１ｍｌ于１．５ｍｌ离心管中，１０ ０００ｒ／ｍｉｎ离心２～５ｍｉｎ，弃上清液，沉淀采用生理盐水清洗２次，弃上清液。加入ＴＥ缓冲溶液２００μｌ，蛋白酶Ｋ ４０μｌ，裂解液１６０μｌ，充分混匀，６０℃水浴作用１５～２０ｍｉｎ，加入无水乙醇２００μｌ，采用吸附柱收集ＤＮＡ模板，清洗剂为７０％的乙醇。
１．４ 结核分枝杆菌特异性片段的ＰＣＲ扩增
采用提取的Ｄ
ＮＡ模板，利用合成的引物在ＰＣＲ酶的作用下进行扩增。反应体系和条件如下：２×Ｔａｑ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ－Ｍｉｘ为１２．５μｌ，标准结核杆菌ＤＮＡ模板２μｌ，样本ＤＮＡ模板５μｌ，２０μＭ的上下引物各０．７５μｌ，加入ｄｄＨ２Ｏ至２５μｌ
，·２·《上海畜牧兽医通讯》 ２
０１２年第１期
在Ｔｇｒａｄｉｅｎｔ９６扩增仪下进行３０次如下循环：９４℃变性５ｍｉｎ，９４℃４０ｓ，６３℃４０ｓ，７２℃６０ｓ，３０个循环，７２℃延伸７ｍｉｎ。反应结束后取７μｌ扩增产物进行１％琼脂糖凝胶电泳检测。
１．５ ＰＣＲ法扩增的特异性测定
分别用牛结核分枝杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、大肠杆菌、魏氏梭菌、巴氏杆菌、金葡萄球菌、链球菌ＤＮＡ为模板，进行ＰＣＲ扩增，以鉴定所建ＰＣＲ方法的特异性。
１．６ ＰＣＲ法扩增的敏感性的测定
采用型号为ＴＵ－１８００ｓｐｃ的紫外可见光光度计，测得牛结核分枝杆菌标准ＤＮＡ模板的平均ＯＤ２６０值为０．０４０ｎｍ，根据模板浓度的计算方法进行计算，结果是：ＤＮＡ模板的含量为０．３０４μｇ／μｌ。按１０倍稀释法进行稀释后，则牛结核分枝杆菌标准ＤＮＡ浓度依次为３０４ｎｇ／μｌ，３０．４ｎｇ／μｌ，３．０４ｎｇ／μｌ，３０４ｐｇ／μｌ，３０．４ｐｇ／μｌ，３．０４ｐｇ／μｌ，３０４ｆｇ／μｌ，３０．４ｆｇ／μｌ，３．０４ｆｇ／μｌ，取２μｌ进行ＰＣＲ扩增。
１．７ 样本的检测试验
采用ＰＣＲ检测方法，对２９８头份牛奶和２２９份牛全血样本进行检测，同时，鲜牛奶样本还经罗氏培养后采取ＰＣＲ方法进行检测；全血样本对应牛同时还用ＰＰＤ进行了皮内试验。
２ 试验结果
２．１ 牛分枝杆菌培养结果
将牛分枝杆菌接种于改良罗氏培养基上，３７℃培养约１５～３０ｄ，可观察到米黄、粗糙、隆起、不透明、边沿不整齐，呈颗粒结节的菌落。提取的染体ＤＮＡ经电泳检测，长度符合要求。
２．２ 结核分枝杆菌特异性片段的ＰＣＲ扩增
上海的旅游景点 应用合成的一对引物，对提取的牛结核杆菌ＤＮＡ模板、阳性样本提取的ＤＮＡ模板及阴性对照样本进行ＰＣＲ扩增，电泳检测显示牛结核杆菌、阳性样本约在４７８ｂｐ处出现一条ＰＣＲ目标带，与预计的结果非常接近（见图１）。２．３ ＰＣＲ方法的特异性测定
分别用牛结核分枝杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、大肠杆菌、魏氏梭菌、金葡萄球菌、链球菌、巴氏杆菌、沙门氏菌ＤＮＡ为模板，进行ＰＣＲ扩增，除牛结核分枝杆菌出现目标条带，其它细菌未见特异性４７８ｂｐ片段扩增（见图２）
。
２．４ ＰＣＲ法扩增的敏感性的测定
采用型号为ＴＵ－１８００ｓｐｃ的紫外可见光光度计，测得牛结核分枝杆菌标准ＤＮＡ模板的平均ＯＤ２６０值为０．０４０ｎｍ，根据模板浓度的计算方法进行计算，结果是：ＤＮＡ模板的含量为０．３０４μｇ／μｌ。按１０倍稀释法进行稀释后，依次取２μｌ进行扩增，可检出的牛结核分枝杆菌标准ＤＮＡ模板的含量最小是３０．４ｐｇ／μｌ（见图３）
。
２．５ 样本的检测试验
轨迹２．５．１ 奶样的检测结果是：采用直接从牛奶中提取ＤＮＡ模板，然后进行ＰＣＲ扩增，测出阳性样本３３份，其中，奶牛场Ａ为１１份，奶牛场Ｂ为１５份，奶牛场Ｃ全部为７份，奶牛场Ｄ全部为阴性。采用鲜奶接种于罗氏培养基上培养，再将生长出的菌进行ＰＣＲ扩增，检测出的阳性样本共３４份，其中，
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黎明演唱会《上海畜牧兽医通讯》 ２０１２年第１期
奶牛场Ａ为８份，奶牛场Ｂ为２６份，奶牛场Ｃ全部为阴性，奶牛场Ｄ全部为阴性。
２．５．２ 全血样本的检测结果是：采用直接从全血中提取ＤＮＡ模板，然后进行ＰＣＲ扩增，测
出阳性样本４３份，其中，奶牛场Ⅰ为１３份，奶牛场Ⅱ为１２份，奶牛场Ⅲ全部为阴性，某种畜场种牛为１８份。用ＰＰＤ进行皮内试验，检出阳性样本５２份，奶牛场Ⅰ为２２份，奶牛场Ⅱ为１３份，奶牛场Ⅲ全部为阴性，某种畜场种牛为１７份。
３ 讨论
３．１ 牛结核病是一种人畜共患的慢性传染病，目前结核病在全球范围内呈蔓延趋势，要消灭和控制牛结核病，关键是要对该病进行诊断。为此，
dnf如何增加疲劳值我们根据牛结核分枝杆菌复合物的插入序列ＩＳ６１１０的基因序列设计引物，建立了牛结核病的ＰＣＲ检测方法。实验表明，采用ＰＣＲ反应系统可检测出３０．４ｐｇ牛结核分枝杆菌纯化ＤＮＡ，特异性实验表明，除牛结核分枝杆菌的特异扩增带（４７８ｂｐ）外，其他的细菌均未出现特异性扩增带。通过对２９８头份牛奶和２２９份牛全血样本进行检测，检出阳性牛奶样本３３份，阳性全血样本４３份；鲜牛奶样本同时还在罗氏培养后采取ＰＣＲ方法进行检测，检出阳性样本３４份；全血样本同时还用ＰＰＤ进行皮内试验，检出阳性样本５２份。说明ＰＣＲ方法敏感性强、特异性高。
３．２ 由于ＰＣＲ方法的敏感性高，所以就特别容易有假阳性的出现，
因此要避免标本之间的污染，标本对试剂的污染和环境对标本的污染，标本在处理过程中，既要注意
细菌ＤＮＡ的完全释放，又要注意ＤＮＡ释放的完整性，避免造成假阴性。在牛奶和全血样本的检测结果中，除按照预期结果在４７８ｂｐ处出现了目标带，但同时伴有非目标带的出现，可能是由于循环过程中退火的温度较低，或是提取的ＤＮＡ模板仍含有蛋白质等杂质，
或是引物的设计还有一定的缺陷等，最后导致扩增结果有非目标带的出现。
３．３ ＰＣＲ技术在牛结核病的诊断上的应用，是将该病的诊断提高到了分子和基因水平，而且整个实验过程仅需６ｈ，从而有益于结核病的早期诊断。ＰＣＲ技术尤为适用于如结核病等生长缓慢和难以培养的病原微生物鉴定，它将为结核病的细菌学基因诊断开辟广阔前景。
参考文献
〔１
〕蔡宏，李淑霞，呼西旦，等．利用聚合酶链反应技术检测牛结核杆菌病的研究〔Ｊ〕．中国预防兽医学报，１９９９，２１（４）：２９１～２９４．〔２〕徐克前．分子生物学检验技术实验指导〔Ｍ〕．北京：
人民卫生出版社，２００３．
〔３〕扬卫冲．牛结核病诊断技术的研究进展〔Ｃ〕．
中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第十次学术研讨会论文集，２００３，１０：１０９６～欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈欈氜
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