全长16S:细菌的“第二代身份证”
全长16S：细菌的“第⼆代⾝份证”
16S rRNA基因⼀直被作为微⽣物落中细菌“⾝份”的分⼦标记。通过对16S rRNA基因特定区域进⾏扩增和测序，可以研究环境样品中微⽣物落组成以及相对丰度。随着测序技术的发展，读长更长的三代测序技术被⽤到16S扩增⼦测序中。相⽐于基于短读长测序技术的16S扩增⼦测序，基于PacBio等三代测序技术的扩增⼦测序可以实现对16S rRNA基因全长序列的⾼精度测序，从⽽实现更准确的落组成鉴定。因此，可以说全长16S扩增⼦测序是细菌的“第⼆代⾝份证”。
⼀、16S rRNA基因：细菌的“⾝份”标志
16S rRNA基因（16S rDNA）编码原核⽣物核糖体⼩亚基rRNA，长度约为1542bp，包含10个保守区和9个⾼变区。16S rRNA基因⼀直被作为细菌系统分类学研究中最常⽤和最有⽤的分⼦标记，是因为其具有以下优势：
1. ⼴泛存在于所有原核⽣物中
编码原核⽣物核糖体⼩亚基rRNA，因此在所有原核⽣物基因组中均存在。
2. 具有⾜够的系统发育信息
同时具有保守区和可变区，保守区在物种间差异不⼤，反映了物种间的亲缘关系；⾼变区具有属或种特异性，能体现物种间的差异。
国产奶粉排名3. 易于扩增
长度仅为1542bp，⽽且保守区为扩增提供了良好的引物结合区域。
4. 信息数据库全⾯阜新旅游景点大全
Greengenes、Silva和RDP等数据库为基于16S序列的物种注释提供了全⾯的分类信息。
⼆、全长16S扩增⼦测序的优势
与⼆代短读长测序技术相⽐，PacBio长读长测序技术具有许多明显优势，这些优势为基于16S序列的物种注释提供了更准确和全⾯的信息。
1. 长读长
⼆代测序读长仅为⼏百bp，⽽PacBio测序读长可达⼏⼗甚⾄上百kb。对于长度约为1542bp的16s rRNA基因，⼆代测序只能⽤于对16S rRNA 基因的部分区域进⾏测序，⽽PacBio测序可轻松跨越16S rRNA基因的全长序列；
2. 测序过程⽆PCR
⼆代测序过程中的PCR可能引⼊⼈为的碱基错误，⽽PacBio测序直接进⾏单分⼦实时测序，避免了PCR过程中的⼈为错误；
3. ⾼碱基准确性
PacBio HiFi Reads碱基准确性⾼达99%以上。物种注释时是基于OTUs序列的⼀致性，因此测序准确性对准确的物种注释⾮常关键。
与基于短读长的⼆代16S扩增⼦测序相⽐，基于PacBio的全长16S扩增⼦测序在微⽣物多样性研究中的优势包括：
1. 提⾼物种注释准确性和分辨率
与16S部分区域的扩增和测序相⽐，PacBio全长16S扩增⼦测序是对16S rRNA基因的全长序列进⾏扩增和测序。全长序列能为物种注释提供更全⾯和准确的信息。PacBio全长16S扩增⼦序列的分析⼀⽅⾯可以注释到更多的OTU，显著提⾼注释物种的准确性，另⼀⽅⾯可以提⾼物种注释的分辨率，实现“种”⽔平的物种注释。
图1 部分和全长16S间物种注释准确性的差异（图⽚引⾃⽂献[1]）（图1 左上：不同区域未注释到种⽔平的⽐例；左下:
不同区域OTU的数⽬；右图: 进化分⽀的红⾊代表不能注释到种⽔平的⽐例）
图2 部分和全长16S间“种”⽔平物种注释的差异（图⽚引⾃⽂献[2]）
2. ⽆样品和物种偏好性
16S rRNA基因的不同区域的变异在不同物种分类中具有不同的偏好性。因此，不同区域的⼆代扩增⼦测序对不同来源和物种组成样本的注释准确性会有偏差。⽽全长16S扩增⼦测序由于是对16S rRNA基因的全长序列进⾏测序，具有更⼴泛的样品和物种适⽤性，避免了常规扩增⼦测序的不同测序区域带来的对不同样品来源和物种的偏好。
图3 部分和全长16S的物种偏好性⽐较（图⽚引⾃⽂献[2]）
三、应⽤案例
近年来，全长16S扩增⼦测序技术在⼈类健康、农业领域、⾷品⼯程、环境⼯程和极端环境⽅向均被⼴泛应⽤。
1. 肠道菌
⼈体和其共⽣的微⽣物⼀起组成了整个庞⼤⽽缜密的“个体”，⼈体细胞是微⽣物细胞总数的1/10，⼈类的基因只有微⽣物基因的1/100。“肠道菌”是⼈体的“第⼆⼤基因组”。肠道是⼈体和动物的重要器官，主要负责营养物质的消化和吸收。肠道作为体内最⼤的淋巴组织，还兼具内分泌及免疫调节的功能。肠道上⽪细胞是机体与外环境的屏障，肠道中的微⽣物（肠道菌）与肠道的代谢功能与免疫功能密切相关。⽬前，据不完全统计，利⽤PacBio 全长16S扩增⼦技术来研究肠道菌的物种主要有⼈、猪、羚⽺、斑马鱼、鲑鱼等。
2020年9⽉发表在《Microbial Biotechnology》上的《Modulation of gut mucosal microbiota as a mechanism of probiotics-based adjunctive therapy for ulcerative colitis》[3]。该研究以分别服⽤美沙拉嗪+益⽣菌组（n = 12）和美沙拉嗪+安慰剂组（n = 13）的25名溃疡性结肠炎（UC）患者为研究对
象。利⽤结肠镜检查获得的活检样本进⾏全长16S扩增⼦测序，结果表明，服⽤益⽣菌的患者炎症症状好转，肠道菌多样性更丰富，并且有益菌增加。该研究通过利⽤益⽣菌的辅助，为缓解UC症状的机制提供了新思路。益⽣菌可能通过调节肠道粘膜微⽣物来缓解UC症状。
图4 对溃疡性结肠炎患者肠道菌的影响（图⽚引⾃⽂献[3]）
2. ⼝腔微⽣物魔兽小鸡快跑攻略
⼝腔微⽣物落是指定植于⼈体⼝腔的微⽣物集合，当微⽣物落与宿主间的⽣态关系失衡时，可诱发多种⼝腔感染性疾病，包括龋病、⽛周病、智齿冠周炎、⽛髓根尖周病颌⾻⾻髓炎等。甚⾄⼝腔微⽣物落结构与糖尿病、⼼⾎管疾病等疾病紧密相关。⼝腔微⽣物落结构可作为⼝腔及全⾝健康的重要标记。研究⼝腔微⽣物多样性⼀般以唾液、痰液等样本为研究对象，⽬前⼝腔微⽣物利⽤PacBio 全长16S扩增⼦技术在慢性阻塞性肺疾病、龋齿、⽛周炎、⽛菌斑等均有⽂献报道。妃嫔等级
2017年11⽉发表在《Frontiers in Microbiology》上的《Profiling of Oral Microbiota in Early Childhood Caries Using Single-Molecule Real-Time Sequencing》[4]。本研究以21名3-5岁患有严重的早期龋齿⼉童和20名年龄匹配⽆龋⼉童作为研究对象。收集唾液样品，利⽤Pacbio全长16S扩增⼦测序研究⼝腔微⽣物落差异。结果发现：⽆龋齿⼉童⼝腔微⽣物落结构相对稳定，有龋齿⼉童⼝腔微⽣物落结构物种变化较⼤。乳酸杆菌，普⽒菌和韦罗⽒菌可能与龋齿的发⽣机制相关。
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图5 ⽆龋齿⼉童和早期龋齿⼉童⼝腔微⽣物物种差异分析（图⽚引⾃⽂献[4]）
3. ⼟壤微⽣物
抽油烟机安装⼟壤为复杂的⽣态系统，⼟壤微⽣物是⼟壤的重要组成部分，⼟壤微⽣物也是根系微⽣物的主要来源。⼟壤微⽣物在⽣态环境中起到⾄关重要的作⽤，如参与⼟壤养分循环、分解有机物质、形成⼟壤团粒结构、传播作物疾病和⽣物防治、增加⼟壤养分有效性进⽽增加植物对养分的利⽤、缓解逆境⼟壤对作物⽣长和⽣产的压⼒、加强根系⽣长以及根部修复等。揭⽰⼟壤微⽣物落结构、多样性及其时空分布特征对于提⾼⼟壤资源利⽤效率、保障⼟壤质量和健康以及⽣态系统可持续发展具有重要的理论和实践意义。
重⾦属污染是较严重的环境污染问题，它对农作物⽣产和⼈类活动产⽣了不利影响。重⾦属污染⼟壤的微⽣物落结构和组成也发⽣了变化。2019年9⽉，发表在《Microorganisms》上的《Identification of Microbial Profiles in Heavy-Metal-Contaminated Soil from Full-Length 16S rRNA Reads Sequenced by a PacBio System》[5]。本研究基于全长16S扩增⼦测序技术对韩国重⾦属⼟壤微⽣物落结构进⾏研究，结果表明：电导率和重⾦属是影响微⽣物落结构变化的关键因素，嗜盐杆菌和卤化硫杆菌可能在重⾦属分解代谢中发挥重要作⽤。该研究还发现了Conexibacter属的序列，这个物种利⽤⼆代扩增⼦测序技术很难鉴定到，该结果同时证实了PacBio全长16s测序技术在物种鉴定⽅⾯有更⾼的分辨率。
图6 污染⼟壤样品中物种统计（图⽚引⾃⽂献[5]）
4. ⽔体微⽣物
⽔体中富含微⽣物⽣长所需的各种营养，是微⽣物的天然⽣境。海洋、河流、湖泊、地下⽔和饮⽤⽔中有丰富的微⽣物。⽔质的优良、⽔华的爆发、污染物的降解都与⽔体中的微⽣物密切相关，此外，⽔体中携带的病原菌也是疾病传播的主要因素。
快速砂⽣物过滤池（RSBF）在去除饮⽤⽔中污染物处理系统中被⼴泛⽤。⽣物滤池中的⽣物膜微⽣物落结构在污染物的⽣物转化中发挥着重要作⽤。2019年12⽉发表在《Water Research》上的《Single molecule sequencing reveals response of manganese-oxidizing microbiome to different biof
ifilter media in drinking water systems》[6]。本研究利⽤PacBio全长16S扩增⼦测序技术对磁铁矿砂RSBF（40d、80d、120d，9个样本）和锰砂RSBF（40d、80d、120d，9个样本）中细菌落进⾏研究。研究发现，两种模式过滤池中的优势菌有显著差异。RSBF中的优势物种是锰氧化细菌。锰砂RSBF中细菌相关性更⾼。两个RSBF反应器的核⼼细菌组成随着时间的变化趋于⼀致。
图7 MagSeRSBF和MnSeRSBF中优势物种丰度⽐较（图⽚引⾃⽂献[6]）
参考⽂献：
1. Johnson J S , Spakowicz D J , Hong B Y , et al. Evaluation of 16S rRNA gene sequencing for species and strain-level microbiome analysis[J]. Nature Communications, 2019, 10(1).
2. Pootakham Wirulda,Mhuantong Wuttichai,Yoocha Thippawan et al. High resolution profiling of coral-associated bacterial communities using full-length 16S rRNA sequence data from PacBio SMRT sequencing system.[J] .Sci Rep, 2017, 7: 2774.
3. Modulation of gut mucosal microbiota as a mechanism of probiotics‐based adjunctive therapy for ulcerative colitis[J]. Microbial Biotechnology, 2020.

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