细胞冷冻与复苏
第8章 细胞的冷冻保存复苏技术

细胞株(系)的使用，为医学研究和测试工作带来了极大的方便。但细胞的传代是有限制的，长期连续传代的细胞，不仅消耗大量的人力和物力，而且细胞的生长与形态等会有一定退变或转化，因而细胞失去原有的遗传特性，有时还会由于细胞污染而造成传代中断，种子丢失。因此，在实际工作中常需冻存一定数量的细胞，以备替换使用。细胞冷冻与复苏是细胞培养室的常规工作和通用技术。

第一节 细胞的冻存

一、概述
目前，细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应。如细胞脱水使局部电解质浓度增高，pH值改变，部分蛋白质由于上述原因而变性，引起细胞内部空间结构紊乱，溶酶体膜由此遭到损伤而释放出溶酶体酶，使细胞
内结构成分造成破坏，线粒体肿胀，功能丢失，并造成能量代谢障碍。胞膜上的类脂蛋白复合体也易破坏引起细胞膜通透性的改变，使细胞内容物丢失。如果细胞内冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成细胞核DNA空间构型发生不可逆的损伤，而致细胞死亡。因此，细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成。采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。慢速冷冻方法又可使细胞内的水分渗出细胞外，减少胞内形成冰结晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤。
二、主要冷冻设备和材料
常用的细胞冷冻贮存器为液氮贮存器，规格有35L3和50L3两种。使用时要注意以下几点：
（1）一般两周需充液氮一次，至少一个月充氮一次。液氮温度达-196℃，使用时注意勿让液氮溅到皮肤上，以免引起冻伤。尤尤的复仇
（2）液氮容器为双层结构，中间为真空层，瓶口有双层焊接处，应防止焊接部裂开。
（3）在装入液氮时，要注意缓慢小心，并用厚纸卷筒或特制漏斗作引导，使液氮直达瓶底，如有专用液氮灌注装置则更好。若为初次使用，加液氮时更要缓慢，以免温度骤降而使容器损坏。
细胞冻存时常备的材料有：0.25%胰蛋白酶，含10%～20%的血清培养液，DMSO(分析纯)或无新鲜甘油(121°C蒸气高压消毒)，2mL安瓿（或专用细胞冻存管）、吸管、离心管、喷灯、纱布袋（或冻存管架）等。
三、细胞冻存方法
主要操作步骤为：
（1）选择处于对数生长期的细胞，在冻存前一天最好换液。将多个培养瓶中的细胞培养液去掉，用0.25% 胰蛋白酶消化。适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。悬浮生产细胞则不要消化处理。然后将细胞收集于离心管中离心(1000r/min，10分钟)。
（2）去上清液，加入含20%小牛血清的完全培养基，于4℃预冷15个人所得税扣除标准分钟后，逐滴加入已无菌的DMSO或甘油，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，细胞浓度为3×106～1×107/mL之间。
（3）将上述细胞分装于安瓿或专用冷冻塑料管中，安瓿装1～1.5mL在火焰喷灯上封口，封口处要完全封闭，圆滑无勾。冷冻管要将盖子盖紧，并标记好细胞名称和冻存日期，同时作好登记（日期、细胞种类及代次、冻存支数）。
（4）将装好细胞的安瓿或冻存管装入沙布袋内；置于液氮容器颈口处存放过夜，次日转入
大开头的成语液氮中。采用控制降温速度的方法也可采用下列步骤：先将安瓿置入4℃冰箱中2～3小时，再移至冰箱冷冻室内3～4小时（此步可省略），再吊入液氮容器颈气态部分存放破案电视剧排行榜2小时，最后沉入液氮中。
细胞冻存在液氮中可以长期保存，但为妥善起见，冻存半年后，最好取出一只安瓿细胞复苏培养，观察生长情况，然后再继续冻存。

第二节 细胞的复苏

一、细胞复苏的原则
在实际操作中，冻存细胞要进行复苏，再培养传代。复苏细胞一般采用快速融化法。以保证细胞外结晶快速融化，以避免慢速融化水分渗入细胞内，再次形成胞内结晶损伤细胞。
二、细胞复苏的主要操作步骤
（1）佩戴眼镜和手套，从液氮罐中取出安瓿或冷冻管。
（2）迅速放入38℃水浴中，并不时摇动，在1分钟内使其完全融化，然后在无菌下取出细胞。
（3）在1000r/min速度下离心5～10分钟，弃去上层液，加入适量培养液后接种于培养瓶中，接种浓度1×109/L，置37℃温箱静置培养，次日更换一次培养液，继续培养，观察生长情况。若细胞密度较高，及时传代。或无需离心直接将细胞加入瓶中，并加入培养基贴壁培养12～24小时后，充去上清，换入新鲜培养基继续培养。
三、注意事项
在细胞复苏操作时，应注意融化冻存细胞速度要快，可不时摇动安瓿或冷冻管，使之尽快通过最易受损的温度段（-5～0℃）。这样复苏的冻存细胞存活率高，生长及形态良好。然而，由于冻存的细胞还受其他因素的影响，有时也会有部分细胞死亡。此时，可将不贴壁、飘浮在培养液上（已死亡）的细胞轻轻倒掉，再补以适量的新培养液，也会获得较为满意的结果。

第三节 细 胞 的 运 输

由于培养细胞株(系)的商品化，细胞培养室之间的交流、交换和购买已成为生命科学研究中的一个重要组成部分，培养细胞的运输成为研究工作的一个重要环节。如果不了解所要
细胞的性状、培养液特点及培养注意事项，运输时不注意使用特殊容器或温度等，就可能影响细胞的生长，或出现差错，或导致培养失败等。
装运细胞的主要方法如下：
一、 冷冻储存运输
这是一种利用特殊容器内盛液氮或干冰的运输方法。保存效果较好，但缺点是比较麻烦，不宜长时间运输，多需空运，代价较大。
二、 充液法
此种方法较为简单。一般选择生长良好的细胞，以生长1/3～1/2瓶底壁为宜，去掉旧培养液，补充新的培养液至瓶颈部，保留微量空气，拧紧瓶盖，并用胶带密封，放在一运送盒内，用棉花等做防震防压处理。运输时间需注册苹果id4～5天，一般放在贴身口袋即可，到达目的地后倒出多余的培养液，只需保留维持生长所需的培养液置37℃培养，次日传代。如果在市内运输或仅需数小时运输路程，也可将细胞附着面朝上，或把培养液全部倒掉放在胸部口袋运送。靠附着于细胞表面的培养液，可使细胞短时间不受损。
培养细胞时为防止以下问题，细胞将做冷冻保存:第一、株化细胞产生性状转变(transformation)。第二、污染。第三、株化细胞之增殖或生理特性有特定之限制，只能在
几月几日是圣诞节一定的代数范围内进行增殖培养或进行特定实验。目前可能解决这些困难的方法其中之一是细胞冷冻保存法，将冷冻细胞储于冷冻管中，将其中一部分拿出来做一些必要的检查，其它的冷冻细胞则在需要时拿出来解冻，用来进行实验。本方法亦可节省继代培养时所花费的劳力、物力，并可防止培养中经常发生意外事故，丧失细胞珠。因此冷冻保存法为细胞培养研究上之基本技术之一。

[说明] :
1.经过冷冻保存后的细胞，其生存率会下降，冷冻时之冷却速度，保存温度，解冻时升高温度的速度以及添加之冷冻保存液之种类、浓度等都可影响细胞存活率。
2. 一般而言，４℃以下慢慢地冷冻，保存于液态氮中(-196℃)。
3. 37℃快速解冻。
4.保护剂（抗冻剂）：添加甘油 (glycerol) ( I0 %左右 ) 或dimethy1sulfoxide (DMSO) ( 5- 10% ) 。
5.有些细胞如果采用上述的方法时，无法得到高的存活率。此时，则必需考虑可能伤害细胞的机制，添加剂之作用等而来出适当的条件来修正。


[材料] :
1.增殖期之细胞 (9成满)，培养于培养皿中数个。
2.冷冻用培养基(2倍) : 培养基内加入三倍血清及15% DMSO，保存在冰箱中。
3. 冷冻管、保利龙制容器、铝制ample支持棒。

[步骤]:
1.准备2 x 107cells/ml的细胞悬浮液。
2.冷冻用培养基(2倍) :以微温水溶解DMSO，在培养基中混合为15% (v/v)。这是DMSO的二倍浓度之溶液。必须在进行实验前在行配制，配好后放在冰箱中，使用量必须和细胞悬浮液的量相等；使用时维持在4℃。
3.分装: 在冷冻管管中分别加0.5ml (1/2冷冻管体积)冷冻用培养基(2倍)及2 x 10(7次方)cells/ml的细胞悬浮液；等量混合。将盖子扭紧后，在管中部贴上胶带密封。
4.记载卷标 : 用抗冻marker pen在冷冻管上写明细胞名称、代数、冷冻的年，月，日等所需要的项目。
5.放进冷却的保利龙容器中，而在- 80℃的超低温槽中放置一个晚上。
6.放进液态氮容器中及保存 : 在支持棒上装上冷冻管，迅速地放进容器内。

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