VF电泳法
等电聚焦水平板电泳法
两性电解质在电泳场中形成一个pH梯度，由于蛋白质为两性化合物，其所带的电荷与介质的pH值有关，带电的蛋白质在电泳中向极性相反的方向迁移，当到达其等电点(此处的pH值使相应的蛋白质不再带电荷)时，电流达到最小，不再移动。本法用于检测蛋白类和肽类供试品的等电点。
除另有规定外按以下方法测定。
1.仪器装置恒压或恒流电源、带有冷却装置的水平电泳槽和制胶模
具。
2.试剂
(1)水(电阻率应不低于18M/D•cn)
(2)A液称取丙烯酰胺5.0g，亚甲基双丙烯酰胺0.15g，加适量水溶解，并稀释至50ml，双层滤纸滤过，避光保存。
(3)B液10%过硫酸镂溶液，新鲜配制。
(4)甲基红试液称取5mg甲基红，溶于10mL0.05mol/L氢氧化钠
买卖协议书范本中。怎么解绑手机号
手表排行榜大全(5)50%甘油
(6)正极液0.5mol/L磷酸溶液
琵琶语 龚琳娜(7)负极液1mol/L氢氧化钠溶液
3.操作法
(1)制胶取A液2.5ml,pH3~10的两性电解质(或其它pH范围的两性电解
质)0.35ml，水1.25ml,50%甘油0.5ml，抽气5〜10分钟，力口B液25dlN,N,N',N■四甲基乙二胺6^J混匀后缓慢的注入水平模具内，室温下聚合O
(2)预电泳将已聚合的聚丙烯酰胺凝胶放到冷却板上，其间涂以液体石蜡或煤油并避免气泡的产生。用正极液与负极液分别润湿正极与负极电极条，然后分别放于阳极与阴极上，将电极对准电极条中心，
加盖，在恒压法下进行测定，在起始电压200V 下预电泳30分钟。
(3)对照品溶液和供试品溶液的制备将供试品对水透析(或用其它
方法)脱盐，并将蛋白或多肽含量调节至0.5〜5mg/ml(如供试品蛋白或多
肽浓度太低，则需采用适当方法浓缩)。对照品溶液同供试品溶液制备。
(4)电泳将加样滤纸条以一定间隔置于凝胶上，加入供试品、对照品及等电点标准溶液5〜20dl i选择恒压方式进行电泳，起始电压为200V。
电泳0.5~1小时待甲基红迁出加样条后，去除加样条。调高电压至400V，电泳至电流不再变化，再调高电压至600V，待电流不再变化时停止电泳。
4.固定和染十大神秘生物
(1)试剂
a.固定液20%三氯醋酸小学六年级语文教学总结
b.染液i)染储备液称取 1.0gG-250，溶于20ml水中，为溶液1；称取125g(NH4)2SO4，溶于400ml
水中，为溶液2；称取20gH3P。4，为溶液3；将溶液3加入到溶液1中，待G-250完全溶解后，与溶液2混合，并加水至1L，混匀后即得，用前应充分混合。
ii)工作染液取60ml染储备液，与30ml甲醇混匀，新鲜配制。
c.脱液蒸储水
(2)固定与染电泳完毕后，取出胶片，置于固定液中固定20分
钟以上，取出胶片，置染液中3小时，用脱液脱至背景透明后取出
晾干，亦可做成干胶永久保存。
5.结果判断
将胶片置凝胶电泳扫描仪中扫描，通过扫描定位法测量蛋白质或多肽与等电点标准的迁移距离。
(1)鉴别供试品主成分迁移位置应与对照品迁移位置一致。
(2)等电点以等电点标准试剂中各种蛋白的等电点(pI)对其相应的迁移距离直线回归作图；将供试品的迁移距离代入直线回归方程，求出供试品的等电点。
版权声明：本站内容均来自互联网，仅供演示用，请勿用于商业和其他非法用途。如果侵犯了您的权益请与我们联系QQ:729038198，我们将在24小时内删除。
发表评论