综合性实验三、抗“O”和抗“H”血清的制备及效价测定
西安医学院教案
（专业课程）
景甜回应背景说
课程名称
临床免疫学与检验
班  级 
检本1008
专业，层次
检验，本科
教  师
武永红
专业技
术职务
讲师
授课方式
（大，小班，实习）
实验
学时
9学时
授课题目（章，节）
抗“O”和抗“H”血清的制备及效价测定
基本教材或主要参考书
王兰兰，许化溪主编.临床免疫学检验.第5版：人民卫生出版社，2012
刘辉．临床免疫学与检验实验指导第3版：人民卫生出版社，2009
模范教师事迹材料
曹励民．免疫学检验实验指导．自编教材，2011
教学目的：
1.掌握：细菌接种培养的操作能力，加强细菌性抗原免疫动物的实验操作能力，肥达氏反应的模拟操作及间接血凝实验测定细菌性抗体的效价，
2.熟悉：临床用于诊断细菌或病毒感染的凝集反应测定效价试验的原理。
教学内容：
1.细菌培养与免疫原的制备
2.“O”和抗“H”血清的制备
3.试管凝集试验测抗“O”和“H”血清效价
4.间接血凝试验测抗“O” 和“H”血清效价
教学方法：启发式教学；讲授重点内容。
教    具：板书  示教
教学重点、难点：
1. 间接血凝试验测抗“O” 和“H”血清效价
教研室审阅意见                             
                                                        （教研室主任签名）
年  月  日
教    学    内    容
教学手段
时间分配
抗“O”和抗“H”血清的制备及效价测定
（一）细菌培养与免疫原的制备
（二）“O”和抗“H”血清的制备
applestore（三）试管凝集试验测抗“O”和“H”血清效价
（四）间接血凝试验测抗“O” 和“H”血清效价
（一）细菌培养与免疫原的制备
伤寒沙门菌标准菌株干粉→生理盐水溶解→接种肉汤培养基→接种普通平板
→生理盐水菌液 （100℃水浴制备O抗原，甲醛处理制备H抗原 ）
（二）“O”和抗“H”血清的制备
Ag伤寒沙门菌O和H抗原→分别免疫两组家兔→抗O血清和抗H血清
O/H抗原的免疫程序：
日序（天）              免疫剂量（ml）                免疫途径
1                          1                        皮内五点注射
8                          1.5                        耳静脉注射
15                        1.5                        耳静脉注射
22                        1.5                        耳静脉注射
放血方法：颈动脉采血
试血方法：试管凝集试验
（三）试管凝集试验测抗“O”和“H”血清效价
试管凝集试验的原理：在试管内，用已知颗粒性抗原作为诊断试剂，与一系列倍比稀释的待检血清混合反应，在一定条件下，出现肉眼可见的凝集现象。
步骤和方法：
1．试管编号标记。
2．试管凝集操作程序（单位：ml六一儿童节祝福语简短唯美）
管号    1    2    3    4    5    6      7    8      9（对照）
生理盐水    0.9    0.5    0.5    0.5    0.5    0.5      0.5    0.5    0.5
1：10血清0.1    0.5    0.5    0.5      0.5      0.5    0.5    0.5    弃                                                                          0.5
诊断菌液    0.5    0.5    0.5    0.5    0.5    0.5    0.5    0.5    0.5
终稀释度1:20    1:40    1:80    1:160  1:320    1:640  1:1280  1:2560  -＃
摇匀置37℃ 2~4h，取出置室温过夜后观察结果。
结果和评价
判断凝集试验结果，要有良好的光源和黑暗的背景，先不振摇，观察试管底部凝集物和上清的浊度。然后轻轻摇动试管，逐一观察凝集颗粒的松软度、大小、均匀度等性状及液体的混浊程度。
1．先观察盐水对照管凝集现象，轻轻摇动试管，细菌分散均匀混浊。
2．伤寒沙门菌O抗原凝集物呈颗粒状沉于管底，轻摇时不易散开（H抗原凝集物呈絮状，疏松而大块地沉于管底，轻摇易离散）。凝集程度通常以“+”表示强弱。
“4+”很强，细菌全部凝集，凝块全沉于管底，液体澄清，凝块全沉于管底。。
“3+”强，细菌大部分凝集，液体稍混浊。
“2+”中等强度，细菌约50%凝集沉于管底，液体较混浊。
西安医学院是几本
“+”弱，仅少量细菌凝集，液体混浊。
“—”不凝集，液体混浊度与对照管相同。
3．只要待测血清管出现“2+”以上的反应现象，就可判断为阳性；以出现“2+”凝集的最大血清稀释度为待检血清的抗体效价。
4．本试验是一经典的定量凝集试验，敏感性不高，但操作方法简单，至今仍在使用。
注意事项
1．试管凝集试验只有在抗原抗体比例适当时才能出现肉眼可见的反应，一般情况下，随着血清浓度的逐渐稀释，凝集反应越来越弱，但在抗体浓度过高时，反无凝集现象出现，此为前带反应现象。出现该情况时，需加大抗体稀释度重新试验。
2．注意温度、电解质、振摇对实验结果的影响。抗原抗体加入后，要充分混匀，以增加抗原抗体的接触。
临床意义、方法评价：
外斐反应——斑疹伤寒立克次体
肥达试验——诊断伤寒、副伤寒
交叉配血
既能定性又能半定量，但特异性、敏感性不高。
（四）间接血凝试验测抗“O” 和“H”血清效价
原理:
将可溶性抗原吸附于一种与免疫无关、大小均匀的载体颗粒表面，再与相应抗体在适宜条件下相互作用，可发生抗原抗体反应而使颗粒被动的凝集，出现肉眼可见的凝集现象，这种方法称间接凝集试验。如将抗体吸附于颗粒表面用以检测抗原，则称为反向间接凝集试验，方法和原理与前者相同。实验室常用的载体有红细胞、胶乳颗粒等。以红细胞为载体颗粒的间接凝集试验称为间接血凝试验。
技术要点：
1．致敏SRBC的制备  取2%SRBC悬液（1滴压积SRBC+2ml生理盐水）与等量1：10伤寒沙门菌O（H）菌液混合，置37℃水浴2小时，其间应该每隔15分钟摇动一次，取出后离心，弃上清液，用生理盐水洗涤3次，最后用生理盐水配成2%的致敏SRBC悬液。
2．间接血凝试验操作程序（单位：ul）
管号    1    2    3    4    5    6    7    8
生理盐水    25    25    25    25    25    25    25    25
1：10O(H)血清    25    25    25    25    25    25    25    弃25
致敏SRBC    25    25    25    25    25    25    25    25
终血清稀释度    1：40    1：80    1：160    1：320    1：640    1：1280    1：2560   
3.结果观察：
-：细胞沉积于孔底。
+ ：细胞沉积于孔底，周围有少量散在凝集。
++：细胞形成片层凝集，面积较小，边缘较松散。
+++：细胞形成片层凝集，面积略大于2+ 。
++++：细胞形成片层凝集，均匀布满孔底，或边缘 皱缩如花边状。
4．方法评价：快速、敏感、操作简便且无需特殊实验设备。
临床应用：间接凝集试验在临床检验中应用广泛，
（1）检测抗原
（2）检测抗体，如抗-HIV抗体、抗溶血素“O”抗体等，类风湿因子、抗DNA抗体等自身免疫性疾病的抗体和青霉素抗体等变态反应的抗体，主要用于检测抗病原生物抗体，如抗脑膜炎球菌、沙门菌、志贺菌、结核杆菌、肝炎病毒、流感病毒、血吸虫等病原体的抗体。
讲解
20分
学生操作
160分
讲解
20分
学生操作
160分
‘
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讲解
20分
学生操作
160分
课程小结蚁人2彩蛋
颗粒性抗原与相应抗体在适当条件下发生反应，出现肉眼可见的凝集小块，称为直接凝集反应。在操作方法上有玻片法和试管法两种。玻片法以已知诊断血清检测未知细菌颗粒性抗原为例；试管法以检测抗体效价为例。试管法倍比稀释，使抗血清浓度呈倍数关系逐步降低。
将可溶性抗原吸附于一种与免疫无关、大小均匀的载体颗粒表面，再与相应抗体在适宜条件下相互作用，可发生抗原抗体反应而使颗粒被动的凝集，出现肉眼可见的凝集现象，这种方法称间接凝集试验。如将抗体吸附于颗粒表面用以检测抗原，则称为反向间接凝集试验，方法和原理与前者相同。实验室常用的载体有红细胞、胶乳颗粒等。以红细胞为载体颗粒的间接凝集试验称为间接血凝试验。
复习思考题
作业题
1．何谓前带效应？
2．抗体效价是如何定义的？
3．引起非特异性凝集的原因有哪些？
4．何谓间接凝集试验？
5．简述间接凝集试验的注意事项？
教学后记
1．教学体会：本次教学主要是让学生掌握试管凝集试验和间接凝集试验的基本操作。
2．评教：让每个学生更充分的操作。
3．评学：学生基本上能够熟练操作。

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