实验三酵母核糖核酸的提取及测定(预习报告范文)
实验三酵母核糖核酸的提取及测定（预习报告范文）
生物化学实验预习报告
一、研究背景
RNA（核糖核酸）普遍存在于动物、植物、微生物及某些病毒和噬菌体内，是遗传信息的载体，由数量不等的核糖核苷酸通过磷酸二酯键连接而成。由于RNA在细胞内能够行使各种各样的生物功能，属酸性高分子化合物，参与蛋白质生物合成，调控基因表达，作为核酶催化生化反应活性，对维持生物体的正常发育有着重要作用。此外，由于RNA还具有较强的保湿性、抗氧化性、强烈的紫外光吸收性、天然助长性以及抗皱防衰、防病治癌等特殊功能，[1]人们在研究基础理论的同时逐渐开始对RNA制剂的开发及应用进行探索。RNA制剂是以RNA及其衍生物为材料，经加工制成的产品，主要包括从富含RNA的生物体中的提取物、自溶物或者降解产物加工制成的各种商品。目前，人们已经开始逐渐接受含RNA制剂的各种产品，需求量日益攀升，RNA制剂已广泛应用于医药、食品、农业、日化、环境保护等方面，具有广阔的商业前景，形成了一大新兴产业。但不管是理论研究还是实际应用，都面临一个问题：RNA往往与细胞内的其他化合物混在一起，离体之后稳定性差、含量低，采用廉价、合
适的手段分离纯化得到RNA显得至关重要。当然，人们已经摸索出来了多种多样的方法，这些方法各有特点，但其基本的思路和程序大致相似，基本战略也是有规律可循的。另外，近年来RNA试剂盒的出现使方便、快速提取纯度高、完整性好的RNA分子也实现了可能。
二、研究目标
1.了解RNA制剂开发应用的前景和基本思路；2.掌握RNA分离纯化的设计思想及主要的操作细节；3.学习酵母RNA提取和测定的操作方法。
三、研究策略
1.选材
即选取富含RNA的生物材料，微生物由于其原料易获得性被广泛应用于工业上大量生产RNA的原料。
2.提取
提取RNA的方法有很多种，如浓盐法、稀碱法、混合盐法、苯酚法、表面活性剂法等
[2]，但在工业生产上应用最多的还是稀碱法和浓盐法。两种方法的原理不同，浓盐法是原理
是在加热条件下，高浓度NaCl改变细胞膜的通透性，使RNA释放出来；稀碱法是利用碱使微生物的细胞壁溶解，释放RNA。两种方法各有特点，浓盐法的破壁率低，但提取的RNA纯度比稀碱法要高；稀碱法的破壁效果好，消耗时间短，能耗低，但提取RNA纯度较低，适于工业化生产。在实际中应根据具体情况及要求选择合适的方法。
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4.含量测定
测定RNA的含量可通过测定核糖核苷酸的糖、碱基或者磷酸来实现。目前有三种方法，定磷法、戊糖测定法和紫外吸收法。定磷比法准确、微量、快速，是测定RNA含量的最好方法；戊糖测定法通过糖的颜反应测定RNA，简单、快速，当样品中有粘多糖和蛋白质存在时会有干扰；紫外吸收法简单、快速、微量，但易受到蛋白质及含有共轭双键物质的
干扰。
四、研究方案及可行性分析
本实验以食品用干酵母粉为材料，采用浓盐法提取核糖核酸并用紫外分光光度法测定制品中RNA的含量。方案合理，实验材料及器具实验室均可提供，时间上也允许，故本方案具有可行性。
五、具体实验设计
1.实验仪器及试剂
仪器：UV9600紫外分光光度计、JP-100架盘药物天平、恒温水浴锅、TDL-40B低速离心机；
器具：微量可调手动移液器、普通大试管、25ml容量瓶、50ml容量瓶、研钵；试剂：10%NaCl溶液、6MHCl、95%乙醇、2%的氨水、RNA沉淀剂、蒸馏水；材料：食品用干酵母粉。
2.实验步骤
（1）酵母核糖核酸的提取（7h）
称取7g酵母粉→研磨至面粉状→转移至三提取分离沉淀RNA角瓶，加50ml10%NaCl溶液→彻底悬浮浸润→沸水浴浸提40min→提取液。提取液→冰浴冷却至少10min→3500r/min离心30min→上清液上清液→小烧杯中冰浴冷却至10℃以下→搅拌下6MHCl调节pH至2.0~2.5→冰浴4h。冰浴后悬浮液→3500r/min离心15min→RNA沉淀→约15ml95%乙醇彻底悬浮搅拌洗涤→3000r/min离心10min→RNA沉淀（重复洗涤、离心三次）。硫酸纸于80℃烘箱干燥→称重→边缘折叠成框→转移RNA沉淀涂布于硫酸纸上→80℃烘箱干燥5min→称重→转移大部分RNA制品于玻璃匀浆器内→称重剩余样品及硫酸纸洗涤纯化干燥→记录数据，计算纯度及产率。（2）核糖核酸含量的测定（紫外分光光度法）（1h）
1匀浆液制备（15min）○
玻璃匀浆器内加入5ml蒸馏水→匀浆至均一的胶体溶液→转入小烧杯（10ml左右蒸馏
水分次清洗并入）→混匀，2%氨水调pH7.0→转入25ml容量瓶，定容，混匀
2含量测定（40min）○
取两支试管，按下表操作
管号ARNA液5mlH2O5ml沉淀剂—B5ml—5mlA、B管混匀→冰浴20min→3500r/min离心10min→取上清液于两支试管→各0.5ml至两个50ml容量瓶，定容，混匀→测定样品OD260值。
（3）原始数据记录处硫酸纸的重量（g）（4）结果计算公式1制品纯度（%）=○
RNA和硫酸纸的总重量（g）样品OD260比消光系数
剩余RNA样品及硫酸纸的总重量（g）1
A管的OD260值B管的OD260值某定量样品稀释倍数某制品纯度某总制品重
7g
定量样品重
某100%
2产率：RNA提取率（%）=○某100%
3.实验所需时间预计本实验共需时间约8h。4.某些试剂与操作的作用
（3）6MHCl调节pH至2.0~2.5在核酸的等电点下使其尽可能多的沉淀，达到与杂质分离的目的。
（4）2%氨水调pH7.0中性pH条件下使RNA尽可能多的溶解，从而使RNA含量测定更准确。
（5）测定OD260值之前将上清液稀释100倍高浓度有可能超出朗伯-比尔范围，使测定结果偏差较大，稀释后测定反而更准确。
5.误差分析
（1）整个实验中搅拌过程一定要缓慢，否则会使RNA机械破碎，影响含量测定。（2）调节等电点时应严格控制pH。因为pH过低会使核酸发生酸性水解，过高则核酸沉淀不完全，
且会使杂质（DNA或蛋白质等）沉淀较多。
（3）紫外法测定RNA含量时，第一次定容要格外小心，切勿超过总体积（容量瓶量程小，只有25ml）。
六、质疑及相关思考
2.等电沉淀法析出RNA时蛋白质及DNA等杂质有多少没有被除去（一起留在了沉淀里）？我们知道，RNA的等电点为2.0~2.5，DNA等电点为4~4.5，蛋白质等电点就变化很大了，我们在保证RNA析出量最多的前提下，肯定会有部分的DNA及蛋白质杂质析出，从而对RNA含量测定造成干扰。既然如此，这些杂质对RNA含量测定的影响有多大？是否可以忽略？

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