第50卷第2期
2021年3月
福建农林大学学报(自然科学版)
Journal of Fujian Agriculture and Forestry University ( Natural Science Edition )
基于转录组的百香果ARF 基因家族的
鉴定及表达分析
张小雪「，韦晓霞2，陈发兴1
(1.福建农林大学园艺学院，福建福州350002；2.福建省农业科学院果树研究所，福建福州350013)
摘要：基于转录组数据对百香果ARF 基因家族(PeARFs )进行鉴定，利用生物信息学软件分析其编码蛋白的理化性质、保守 结构域、保守基序、系统进化情况，同时比较了它们在’福建3号’(黄果)和‘福建1号’(紫果)不同果实成熟阶段的表达差 异.共鉴定得到13个PeARF 成员，其编码的蛋白质含有365 -970个氨基酸，分子质量约为39.95 - 106.33 ku，等电点为5.40
~
8.94，保守结构域分析结果显示，所有PeARF 蛋白质均具有典型的B3和Auxin-resp 结构域，仅4个成员(PeARF6、
PeARF8、PeARF12、PeARF13)具有Aux/IAA 结构域.保守基序分析表明，PeARFs 共包含15个保守基序，每个成员包含保守
基序类型和数目不同.亚细胞定位预测结果显示，13个PeARFs 均定位于细胞核.系统进化分析结果显示,PeARFs 蛋白可分
为4个亚家族.13个PeARFs 基因在果实不同发育期呈现一定的时间和品种表达特异性，其中PeARF 1、PeARF 6、PeARF!、 PeARF 8和PeARF 10在两品种中的表达均随着果实的成熟而下降，而PeARF 12则随着果实的成熟而上升.本研究表明
PeARFs 家族中的部分成员可能与果实的成熟密切相关，结果可为进一步揭示百香果ARF 基因的功能提供依据.
关键词：百香果；ARF ；基因家族；转录组；表达分析
中图分类号：S663.9文献标识码：A
文章编号：1671-5470(2021)02-0236-08
DOI ：10.13323/jki.j.fafu(nat.sci.) .2021.02.013
开放科学(资源服务) 标识码(OS1D )
Transcriptome data-based identification and expression profiling of the auxin
response factor (ARF) gene family in Passiflora edulia Sims
ZHANG Xiaoxue ' , WE1 Xiaoxia 2, CHEN Faxing 1
(1.College of Horticulture , Fujian Agriculture and Forestry University , Fuzhou, Fujian 350002, C
hina ； 2.Fruit
Research Institute , Fujian Academy of Agricultural Sciences , Fuzhou , Fujian 350013, China)
Abstract : Auxin response factor ( ARF ) is a kind of transcription factor that locates in the promoter region of the auxin responsive
genes. ARF can specifically recognize and bind to the auxin response elements and plays important roles in regulating the expression
of the target genes. Based on our previous transcriptome data , the ARF gene family members of passion fruits were identified. Then
their physiochemical properties , protein conserved domain , conserved motifs and evolutionary relationship were elucidated using
bioinformatics analysis. Moreover, their expression patterns in 'Fujian No. 3' ( yellow fruit ) and 'Fujian No. 1' ( purple fruit ) at
different ripening stages were compared. A total of 13 ARF gene family members were identified. The proteins they encoded consisted
of 365-970 amino acids , with the relative molecular weight varying from 39.95 to 106.33 ku and the isoelectric point ranging be tween 5.40 and 8.94. Conservative domain analysis showed that all PeARF proteins contained the typical B3 and the Auxin-resp do
main , and only 4 members ( PeARF6, PeARF8, PeARF12 and PeARF13) contained the AUX/1AA domain. Conservative motif a nalysis results showed that there are 15 motifs in PeARFs, but the type and number of the conserved motifs varied among the gene
family members. Subcellular localization prediction results showed that 13 PeARF proteins were localized in the nucleus. Phylogenet ic analysis revealed that the PeARF gene family could be further divided into 4 subfamilies. The 13 PeARFs genes showed some tem
poral and variety-specific expression at different fruit ripening stages. Among them, the expression levels of PeARF 1, PeARF 6,
PeARF 7, PeARF 8 and PeARF 10 decreased as fruit ripened in both varieties, while the PeARF 12 showed an upward trend. These
收稿日期：2020-07-27 修回日期：2020-10-09
基金项目：农业五新项目(K6018203A)；中央引导地方科技发展专项(2017L3001 )；福建省地方科技发展专项(HKH190278A )；校创新发展 基金(KF2015054).
作者简介：张小雪(1996-)，女•研究方向：果树生理与分子生物学.Email ： 136****************•通信作者陈发兴(1967-)，男，研究员，博士. 研究方向：园艺植物生理与生物技术.Email ：cfaxing@ 126 .
第2期张小雪等：基于转录组的百香果ARF基因家族的鉴定及表达分析-237-
findings indicate that some PeARFs（PeARF l,PeARF6,PeARFl,PeARF S,PeARF IQ and PeARF12）may be closely related to fruit ripening,which provides the basis for a future study on the function of AFR genes in passion fruit.
Key words:passion fruit；auxin response factor；gene family；transcriptome；expression analysis
生长素是一种重要的植物激素，在植物生长发育过程的各个阶段，如胚胎形成、花果发育、顶端优势、维管伸长、叶片膨胀和衰老、侧根形成以及对逆境胁迫响应等，均发挥着重要调控作用［|-3］.生长素应答基因在植物生长发育过程中的表达受到生长素响应因子（auxin response factor,ARF）和Aux/IAA（auxin/in-dole acetic acid）转录因子的调控⑷.近年来，人们对ARF基因的分子结构、表达模
式等进行了大量研究，对不同植物ARF基因的功能及调控机制等方面的研究也逐渐深入⑸.ARF是一类能够特异性识别并结合生长素响应基因启动子区域的AuxREs（TGTCTC）或其突变体（TGTCCC、TGTCAC和TGTCGG），进而促进或者抑制靶基因表达的转录因子⑷.典型的ARFs蛋白常包含3个保守的结构域，即N端DNA结合结构域（DNA-binding domain,DBD）、C端的二聚体结构域（carboxy-terminal dimerization domain,CDT）和可变的中间结构域（middle region,MR）.可变中间区域具有转录激活或抑制作用，激活域富含谷氨酰胺（Q），而抑制域富含脯氨酸（P）、甘氨酸（G）、丝氨酸（S）和亮氨酸（L）7>
拟南芥和其他植物的遗传与分子研究显示,ARF蛋白在控制植物生长发育的调控网络中起着关键作用，其成员的突变会造成不同的植株表型变异.如:AtARF2突变会导致植株晚花、叶片衰老延迟以及种子数量增加⑼；AtARF1/AtARF2双突变体与单突变体表型相似，但表型性状都进一步加强［|0］，表明ARF1与ARF2在功能上具有叠加效应；AtARF6和AtARF8是一对功能冗余的与雌雄蕊生殖能力相关的转录因子, ARF6/ARF8双突变体雄蕊花丝变短，花药延迟开裂，导致植株雌性不育［ll］；AtARF7/AtARF19双突变会抑制不定根的形成和减少侧根数量，而单体突变对不定根和侧根发育无较大影响，表明二者存在功能上的互补［|2］.OsARF16参与水稻对磷酸盐饥饿下的应激反应［l3］；OsARF19通过正调控OsGH3-5和OsBR ll控制水稻叶片夹角大小［14］-关于ARF在果实成熟过程中的调控机制，现有的研究多集中于番茄［15］.番茄中共含有21个ARF家族成员［16］，其中SIARF2通
过负调控与果实成熟相关的调控因子（RIN、CNR、NOR、TAGL1）从而抑制果实成熟［17］；SIARF4通过调控糖代谢从而影响果实早期发育［18］；SIARF9调控发育早期果实的细胞分裂［19］；SIARF12负调控果实膨大但不参与坐果的启动过程［20］；而SIARF10则参与调控果实中叶绿素的形成、淀粉的合成以及糖物质的积累［21］.
尽管ARF基因在植物生长发育的多个方面发挥着重要的作用，但这些基因家族在多年生植物中，尤其是西番莲科的多年生植物中的研究仍然相对匮乏.百香果学名西番莲（Passiflora edulis Sims），是西番莲科西番莲属的几种植物的统称，主要分布于热带和亚热带气候地区，为当地农民的经济产业和增收产业［22］.4福建3号’（黄果）和’福建1号’（紫果）是福建省多个地区均有栽培的优质鲜食百香果品种.本研究基于课题组百香果果肉不同发育时期的转录组数据，利用BlastP程序筛选并鉴定出果肉中ARF家族成员，并对其编码蛋白理化性质、亚细胞定位、保守结构域和系统进化进行分析，同时研究了ARF家族成员在果肉不同发育时期的差异表达模式.预期本研究可为今后百香果ARF基因的功能研究奠定一定基础.
1材料与方法
1.1材料
本研究所用’福建3号’（黄果）和’福建1号’（紫果）果实于2019年采自福建省龙岩市永定区百香果果园.
根据Tu et al［23］的标准，将百香果果实分为幼果期（fruitlet）、绿果期（green）、转期（veraison）、成熟期（maturation）.于’黄果’盛花后的40、55、70和80d进行取样，于’紫果’盛花后的30、44、50和60d进行取样.选择园内12株无病虫害、树势健壮的果树，每株从当年一年生的藤蔓上选取3个形态特征及成熟度相似的果实.采样当天运回实验室，用水果刀将果实去皮留肉，液氮速冻后保存于-80T冰箱中备用. 1.2方法
1.2.1百香果ARF家族成员的鉴定从TAIR数据库（https：///index.jsp）和Phyto-zome12基因组数据库（https：//phytozome.v/pz/p ortal.html）分别下载拟南芥和毛果杨的蛋白质序列文件.首先用百香果转录组的蛋白序列文件构建本地Blast数据库，然后以已报道的23条拟南芥
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ARF蛋白序列为诱饵进行blastp搜索比对.同时，利用HMMER v3.0软件构建ARF的HMM模型，筛选出百香果中含有ARF结构域的蛋白序列(EW10「5).最后，利用NCBI的CCD数据库(https：//bi.nlm. v/Structure/i)检测蛋白结构域，剔除不同时含B3和ARF结构域的蛋白序列.
1.2.2百香果ARF蛋白的保守结构域及Motif分析利用在线软件ExPASy(https：///prot-pa
ram/)预测百香果ARF蛋白的理化性质，并利用Softberry(w ww.softberry/)预测其亚细胞定位.利用NCBI的在线分析工具CDD和MEME5.1.1鉴定PeARF蛋白的保守结构域和保守基序，并采用TBtools进行图形的可视化.
1.2.3百香果ARF蛋白的进化分析利用MUSCLE对百香果、拟南芥和毛果杨中的ARFs氨基酸序列进行多重序列比对，在MEGA X中采用邻接法(NJ)构建系统发育树‘Bootstrap method取值1000、Poission model和pairwise deletion，其余参数默认，利用Evolview对基本树进行进一步美化.
1.2.4百香果ARF表达分析利用本课题组的RNA-seq数据，筛选出两品种在4个发育时期的基因表达数据，基于其FPKM值，利用用TBtools软件对数据采用log法均一化处理并进行热图的绘制.
2结果与分析
2.1百香果ARF基因家族鉴定及蛋白特性分析
通过对转录组数据库的本地Blast比对检索和HMMER搜素，得到50个百香果ARF候选基因，经CCD在线数据库对保守结构域筛选以及剔除不同时含B3和ARF结构域的蛋白序列，最终得到13条百香果ARF蛋白序列，分别命名为PeARFl~13(表1).对13个PeARF基因综合分析表明，不同ARF蛋白间的差异较大：编码ARF蛋白的氨基酸长度范围从365aa(PeARF1)到970aa(PeARF13)，编码区从1098bp (PeAR
F1)到2913bp(PeARF13)，分子质量从39.95ku(PeARF1)到106.33ku(PeARF13)；等电点范围从5.40(PeARF13)到&94(PeARF1),69%的成员等电点小于7，属酸性蛋白，在酸性环境下发挥作用.所有PeARF蛋白的不稳定指数均大于43且亲水系数呈负值，表明13个PeARF均为不稳定的亲水蛋白质；亚细胞定位预测结果表明,13个ARF蛋白质均位于细胞核.
表1百香果ARF家族基因基本信息
Table1Basic information of ARF family genes in passion fruit
基因转录组编号B3结构域auxin-resp
结构域
AUX-IAA
结构域
蛋白所
含氨基
酸个数
分子质
量/ku
等电点
不稳定
指数
脂肪
系数
平均亲
水系数
亚细胞
定位
aph_c1120~222263~34736539.9518.9443.3282.55-0.051N aph_c0127~227253~33539443.945 6.7162.5871.68-0.468N aph_c0199~301326~39941246.597 6.0049.9487.01-0.aph_c1155~257281~36244148.585 6.2860.0478.39-0.aph_c1132~233285~36845550.2048.6848.6171.74-0.aph_c01~4167~146372~46751757.068 6.5547.0172.36-0.aph_c0159~260285~36657462.750 6.2053.3473.68-0.aph_c0129~229255~334589~66369877.547 6.0055.0270.79-0.aph_c0123~224288~37170377.166 6.6149.1078.06-0.aph_c0114~215271~35470877.8807.8743.7576.24-0.aph_c0116~218248~32483494.4088.7489.9368.03-0.aph_c0156~257282~364731~80685594.881 6.1452.7765.73-0.aph c0147~249279~356844~939970106.334 5.4055.6376.47-0.400Nuclear
2.2百香果ARF家族蛋白的进化分析
为了解’黄果’和’紫果’ARF蛋白进化情况，采用MEGAX软件构建了百香果(13个)、拟南芥(23个)和毛果杨(39个)ARFs系统进化树(图1).进化树结果显示,75个ARF成员可被清晰的划分为4个亚家族：Class I、ClassH、Class皿和ClassW，且每组中均含有上述3个物种的成员.其中Class I包含5个PeARF(PeARF6、PeARF3、PeARF8、PeARF2、PeARF12),Class H包含2个PeARFs(PeARF13、PeARF11), Class皿包含2个PeARFs(PeARF7、PeARF4),Class包含4个PeARFs(PeARF1、PeARF10、PeARF5、PeARF9).除PeARF3和PeARF11夕卜，其他成员均能在毛果杨中到同源序列.在Class I中,AtARF12-15、
第2期张小雪等：基于转录组的百香果ARF 基因家族的鉴定及表达分析
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20-23等8个拟南芥成员单独聚在一个小分支上，在百香果和毛果杨等其他2种果树中均未发现与其高
度同源的序列.
p °PtrARF7.4
PoptrARF7.3 PoptrARF7.2 V poptrARF7
△ PoptrARF9.3A PoptrARF9.4
超过35度百香果很难结果
bootstrap 测验采用1 000次重复，节点上的数字代表分枝的可信度，不同分组ARF 蛋白的分枝颜不同.来自百香果的ARF 蛋白
以'PeARF '表示，来自拟南芥的ARF 蛋白以'AtARF '表示，来自毛果杨的ARF 蛋白以'PoptrARF '表示.
图1百香果与拟南芥、毛果杨ARF 基因家族的系统进化树
Fig.1 Phylogenetic tree of the ARFs genes from passion fruit , Arabidopis and Populus trichocarpa
2.3百香果ARF 蛋白结构及保守基序分析
通过CDD 数据库在线分析每个ARF 蛋白的结构域（图2和表1）.结果表明，所有百香果ARF 蛋白均
含有 B3 和 Auxin_resp 结构域，而 PeARF6、PeARF8、PeARF12 和 PeARF13 序列的 C 末端还存在 AUX_1AA
结构域.
Class I Class II
Class III
Class IV
PeARF 13
PeARF11
PeARF7
PeARF4
PeARFI
PeARFIO
PeARF5
PeARF9
PeARF6PeARF3
PeARF8
PeARF2
PeARF 12图2 PeARF 家族蛋白质保守结构域分析
Fig.2 Conserved domains of the PeARF family proteins
利用在线网站MEME 在PeARF 中鉴定获得15个保守基序（图3）.不同PeARF
蛋白序列的基序类型
-240-福建农林大学学报（自然科学版）第50卷
和数量都存在一定的差异.基序1、2属于B3结构域，它们与基序3和基序7共同构成DNA结合结构域；基序4、5、6、10和12属于Auxin_resp结构域；基序8和11属于AUX_IAA结构域；基序9、13、14和15为未知结构域.除PeARF6外，所有序列均含有DNA结合结构域的4个基序，且PeARF7包含两个基序3.13个PeARFs均至少含有Auxin_resp结构域5个基序中的3个（PeARF6,PeARF3和PeARF8缺失基序6、12,PeARF2、PeARF12、ClassU和Class川中所有成员均缺失基序12,Class W中所有成员均缺失基序5）. PeARF6、PeARF8、PeARF9、PeARF10、PeARF12和PeARF13含有AUX_IAA结构域中的所有2个基序，而其它成员无该基序.此外，除PeARF1和PeARF3夕卜，所有序列均含有未知基序9，未知基序13和14仅存在于ClassW成员中（PeARF1不含基序13），而未知基序15只存在于PeARF3、PeARF6和PeARF8中.
Class I Class II Class III Class IV
Motif4
Motif5
PeARF6Motif6
Motif10
PeARF3
PeARF8
PeARF2
PeARF12
PeARF13
PeARFl1
PeARF7
PeARF4
PeARFl
PeARFl0
PeARF5
PeARF9
Motif8
Motif11
Motif9
Motif13
Motif14
Motif12
Motif15
氨基酸数量
图3百香果ARF蛋白的保守Motif分析
Fig.3Conserved motifs in passion fruit ARF proteins
Motif1
Motif2
Motif3
Motif7
为进一步明确PeARFs的蛋白保守结构域，采用MEGAX比对和Genedoc软件分析，发现B3DNA结构域在百香果中高度保守，其中41个氨基酸在所有的序列（PeARF6除夕卜）中完全保守，约占结构域（102aa）平均长度的40.2%；而在具有转录激活或抑制的中心功能区，PeARF11、PeARF13富含谷
氨酰胺，PeARF2、PeARF3、PeARF4、PeARF6、PeARF7、PeARF8、PeARF9、PeARF10、PeARF12富含丝氨酸.
2.4PeARF家族基因的表达分析
从'黄果’和’紫果’转录组数据中提取13个PeARF 在4个果实发育期的表达数据.由图4可知，多数PeARF 基因在果实的不同发育时期均有表达，但PeARF3在两品种的所有发育时期表达极低甚至不表达.随着果实的发育，大部分ARF家族成员的表达量均随着果实的成熟而下降，仅PeARF12在果实的绿果期至成熟期持续增加.
黄果紫果
图4'黄果'和'紫果'果实成熟过程中PeARF
家族基因的表达
Fig.4Heatmap representation of the PeARF genes of'yellow passion ruit'and'purple passion fruit'during ripening
如Class I中的PeARF6、PeARF8；Class川中的PeARF7以
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