婴幼儿配方奶粉在不同贮藏条件下维生素D3稳定性的研究
王 芳1，包怡红2，兰慧娟1
1 北大荒完达山乳业股份有限公司质检中心，黑龙江哈尔滨 150078
2 东北林业大学林学院，黑龙江哈尔滨 150000
摘 要：本文跟踪研究了婴幼儿配方奶粉（简称“婴配粉”）中脂溶性维生素D3在贮藏过程中稳定性的变化。试验方法：将3 种婴配粉经氢氧化钾乙醇溶液皂化、提取、净化、浓缩后，用正相高效液相谱柱制备，反相C18高效液相谱柱分离，经紫外检测器检测，外标法定量检测。试验结果：婴配粉称样量为10.0 g，定容体积为2 mL时，方法检出限为0.303 μg/100 g，方法定量限为0.909 μg/100 g。在此范围内线性回归方程Y=3.3608X+0.0388，此时R2=0.9991。结论：婴配粉中维生素D3的含量在常温和阴凉干燥环境下受到的影响较小；在低温和高温条件下随贮藏时间延长，脂溶性维生素D3因温度分解含量减少。
关键词：婴幼儿配方奶粉（简称“婴配粉”）；维生素D3；稳定性；贮藏条件
中图分类号：TS252.51 文献标识码：B 文章编号：1671-4393（2022）07-0065-05
0 引言
维生素D
3
也叫脂溶性维生素，可调节细胞生长
分化和人体免疫功能，有利于新骨发育和钙化，可促进骨骼生长，预防骨质疏松症[1～3]。对于婴幼儿的
生长发育，维生素D
3
是必不可少的营养元素，也是婴幼儿配方奶粉（简称“婴配粉”）中必须要添加的营养物质。其在受温度及光作用下会变得不稳定
易分解，因此研究在不同贮藏条件下维生素D
3
的稳定性非常必要[4～8]。本文采用《GB 5009.82—2016 食品安全国家标准 食品中维生素A，D，E
的测定》第
四法食品中维生素D的测定——高效液相谱法比较3 种婴配粉中脂溶性维生素D
3
在不同温度的贮藏过程中的含量变化情况，以优化贮藏条件，减少对脂溶
性维生素D
3
含量的影响。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
1.1.1 仪器
高效液相谱仪（紫外检测器），美国Perkin
作者简介：王 芳（1989-），女，黑龙江黑河人，硕士，食品工程师，研究方向为食品工程；
兰慧娟（1991-），女，黑龙江哈尔滨人，本科，食品工程师，研究方向为食品工程。
*通信作者：包怡红（1970-），女，黑龙江哈尔滨，博士，教授，研究方向为食品生物技术与功能性食品。
DOI:10.12377/1671-4393.22.07.14
Quality Control
Elmer股份有限公司；分析天平（感量0.1 mg），梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司；水浴磁力恒温搅拌器，常州华奥仪器制造有限公司；萃取净化振荡器、氮吹仪，北京同泰联科技发展有限公司；旋转蒸发仪、涡旋混合器，德国IKA集团。1.1.2 试剂
氢氧化钾溶液；称取500 g 氢氧化钾，加入400 mL水溶解，冷却后，储存于聚乙烯瓶中；半制备维生素D流动相：环己烷∶正己烷（1∶1）并按体积分数0.8%加入异丙醇；流动相：甲醇（谱纯）。
维生素D 3标准品：购买经国家认证并授予标准物质证书的维生素D 3标准品（纯度≥99%）配制维生素D 3储备液（1 000 μg/mL）和维生素D 3工作液，浓度分别为0.06 μg/mL、0.12 μg/mL、0.24 μg/mL、0.36 μg/mL、0.48 μg/mL、0.60μg/mL。
1.2 试验步骤
1.2.1 试验方法
随机选取超市中3 种不同品牌的幼配粉（12～36 个月），每个品牌4 个样品，在阴凉干燥处（0~4 ℃）、常温（18~20 ℃）、低温（-18 ℃）及高温（30 ℃）4 种贮藏条件下，分别储存4 周，每周测定1 次维生素D 3含量变化。1.2.2 样品处理（1）皂化
称取5 g（精确至0.01g）经均质处理的试样于150 mL平底烧瓶中，试样需加入约20 mL温水，混匀，再加入1.0 g抗坏血酸和0.1 g 2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚，混匀，加入40 mL无水乙醇，加入10 mL 氢氧化钾溶液，边加边振摇，混匀后于60 ℃恒温水浴震荡皂化45 min，皂化后立即用冷水冷却至室温。（2）提取
将皂化液用30 mL蒸馏水转入250 mL的分液漏斗中，加入50 mL石油醚，振荡萃取5 min，将下层溶液转移至另1 个250 mL的分液漏斗中，加入50 mL的石油醚再次萃取，合并醚层。（3）洗涤
用约100 mL水洗涤醚层，约需重复3 次，直至将醚层洗至中性（可用pH试纸检测下层溶液pH值），去除下层水相。（4）浓缩
将洗涤后的醚层经无水硫酸钠（约3 g）滤入250 mL旋转蒸发瓶中，用约15 mL石油醚冲洗分液漏斗及
无水硫酸钠2 次，并入蒸发瓶内，并将其接在旋转蒸发仪上于40 ℃水浴中减压蒸馏浓缩，待瓶中醚液剩下约2 mL时，取下蒸发瓶，立即用氮气吹至近干。用正己烷定容至2 mL，0.22 μm有机系滤膜过滤供半制备正相高效液相谱系统使用的净化待测液[9]。1.2.3 谱条件
（1）半制备正相高效液相谱条件：a）谱柱：硅胶柱，柱长250 mm ，内径4.6 mm，粒径5 μm；b）流速：1 mL/min；c）波长：264 nm。d）柱温：25 ℃；e）进样体积：500 μL。
（2）半制备正相高效液相谱系统适用性试验：取约1.00 mL维生素D 3标准溶液中间液于10 mL试管中，在40 ℃的氮吹仪上吹干。用10 mL正己烷振荡溶解。取该溶液500 μL进行正相液相谱仪测定，确定维生素D 3保留时间。然后将500 μL待测液注入液相谱仪中，根据维生素D 3标准溶液保留时间收集维生素D 3馏分于试管中。将试管置于40 ℃水浴氮气吹干，取出准确加入1.5 mL甲醇振荡溶解，即为维生素D 3测定液。
（3）反相液相谱条件：a）谱柱：C18柱（柱长250 mm，内径4.6 mm，粒径5 μm）；b）柱温：25 ℃；c）流动相：甲醇；d）流速：1.0 mL/min；e）紫外检测波长：维生素D 3为264 nm；f）进样量：维生素D 3为100 μL。1.2.4 结果计算
试样中维生素D的含量按下式计算：
X =
C ×V ×f ×100
m
X：试样中维生素D 2/D 3的含量，单位为微克每百克（μg/100 g）；C：根据标准曲线计算得到的试
样中维生素D 2/D 3的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；V：正己烷定容体积，单位为毫升（mL）；f：待测液稀释过程的稀释倍数；100：试样中量以每100 g计算换算系数；m：试样的称样量，单位为克（g）；计算结果保留三位有效数字[10，11]。
2 结果分析
2.1 标准曲线、检出限及样品定量重复性
根据《GB 5009.82—2016 食品安全国家标准食品中维生素A、D、E的测定》（第四法 食品中维生素D的测定 高效液相谱法）的要求，测量范围应覆盖方法的最低浓度水平（定量限）和关注浓度水平，确定维生素D 3标准曲线浓度范围为0.0101 μg/mL，0.0253 μg/mL，0.1012 μg/mL，0.2024 μg/mL，0.3036 μg/mL，0.5060 μg/mL（浓度均经过分光光度计校正）测定标准曲线，每一点浓度测定3 次，使用3 次数据拟合得到线性参数，各浓度点对应的浓度和峰面积见表1。
从试验结果可见，得出维生素D 3的拟合标准曲线的线性方程为Y=3.3608X+0.0388，此时R 2=0.999 1，大于0.99，浓度范围覆盖关注浓度的0%~150%，满足《GB/T 27417—2017合格评定化学分析方法确认和验证指南》的要求。
采用标准偏差法，选择阴性样品（即试样中本身不含有维生素D 3）试样，称取10 份，每份称取10.0 g 左右，按标准方法进行检测，按LOD的表示方法为3 s（表），LOQ为3 倍的LOD。
从试验结果可见，称样量为10.0 g，定容体积为
2 mL时，方法检出限为0.30
3 μg/100 g，方法定量限为0.909 μg/100 g）。低于该方法规定的检出限和定量限（称样量为10 g，定容体积为2 mL时，方法检出限为0.7 μg/100g，方法定量限为2 μg/100g）。
2.2 不同储存时间维生素D 3含量变化
选取的婴配粉在4 种贮藏条件下，贮存4 周，每周测定1 次维生素D 3含量变化，结果如图3所示。
不同品牌在不同贮藏温度下维生素D 3含量有所不同，3 种品牌最初测定维生素D 3含量分别为6.31 μg/100 g、6.20 μg/100 g、6.00 μg/100 g ，由图所示，在阴凉干燥处（4 ℃）、常温（20 ℃）下，维生素D 3含量随时间变化较小，可忽略不计；在低温（-18 ℃）及高温（30 ℃）下，维生素D 3含量随时间变化含量有所下降。以上表明低温和高温均会对维生素D 3含量有所影响，不利于奶粉贮藏。综上所述，维生素D 3贮藏最佳
表1 维生素D 3标准溶液浓度与对应峰面积
等级浓度（μg/mL）
峰面积（mV*s）
123L10.0 1010.0 7330.0 7490.0 732L20.0 2530.1 2980.1 3140.1 315L30.1 0120.3 5830.3 5140.3 707L40.2 0240.7 0920.7 0760.7 161L50.3 036 1.0 962 1.0 792 1.0 939L6
0.5 060
1.7 305
1.7 128
1.7 399
图1 维生素D 3标准溶曲线
Quality Control
条件为阴凉干燥处[12，13]。
3 小结
本文主要研究结果显示，婴配粉中的维生素
D
3
含量在阴凉干燥环境下和常温环境下几乎没
有变化，但低温和高温均会影响维生素D
3
的含量，主要原因可能是低温或高温条件可引起维
生素D
3分解，导致其含量减少。维生素D
3
含量
随外界贮藏条件的变化在未来几年仍将是受关注的研究领域[14]。C 参考文献
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表2 维生素D3方法检出限与定量限结果
次数12345678910结果（μg/100 g） 1.58 1.48 1.44 1.45 1.46 1.44 1.46 1.46 1.70 1.68标准偏差（s）（μg/100 g）0.101
LOD（μg/100 g）0.303
LOQ（μg/100 g）
0.909图3 不同品牌贮存期维生素D3含量变化
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Study on the Stability of Vitamin D3 InInfant Formula Milk Powder under Different Storage Conditions
WANG Fang1，BAO Yihong1，LAN Huijuan1
1Quality Inspection Center of BeiDaHuang Wandersun Dairy Holdings Co.，Ltd.，Harbin Heilongjiang 150078
2College of Forestry，Northeast Forestry University，Harbin Heilongjiang 150078
Abstract：The stability of fat-soluble vitamin D3 in infant formula milk powder（referred to as "infant formula"）during storage was tracked and studied. Test method：after saponifying，extracting，purifying and concentrating 3 kinds of infant formula powders with potassium hydroxide ethanol solution，they were prepared by normal-phase high-performance liquid chromatography column，separated by reverse-phase C18 high-performance liquid chromatography column，and detected by ultraviolet detector and external standard quantitative method. Test results：when the weighing sample of infant formula powder is 10.0 g and the constant volume is 2 mL，the detection limit of the method is 0.303 μg/100g，and the quantification limit of the method is 0.909 μg/100 g. In this range，
the linear regression equation Y=3.3608X+0.0388，at this time R2=0.999 1. Conclusion：the content of vitamin D3 in infant formula is less affected by normal temperature and cool and dry environment，the content of fat-soluble vitamin D3 decreases due to temperature decomposition under low and high temperature conditions with prolonged storage time.
Keywords：infant formula；Vitamin D3；stability；storage conditions
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