肝细胞癌（HCC ）是最常见的恶性肿瘤之一，是全
球癌症相关死亡的第3大原因，其发病率在全球范围内
仍呈上升趋势，严重威胁着人类健康［1］
。HCC 是肝癌中最常见的类型，占所有病例的90%以上。尽管近几十年来，HCC 的已取得很大进展，患者总生存期和生活质
量有所提高，但在大部分国家5年生存率仍不足30%［2,3］
。因此，需要进一步探索HCC 的有效预防和手段。
Dealcoholized red wine inhibits occurrence and progression of hepatocellular carcinoma possibly by inducing cell cycle arrest and apoptosis
LAN Yu,WANG Kaifeng,LAN Zhixian,ZHOU Heqi,SUN Jian
State Key Laboratory of Organ Failure Research,Guangdong Provincial Key Laboratory of Viral Hepatitis Research,Department of Infectious Diseases,Nanfang Hospital,Southern Medical University,Guangzhou 510515,China
摘要：目的探讨脱醇红酒对肝细胞癌（HCC ）发生发展的抑制作用，并初步探索其可能的机制。方法不同浓度的脱醇红酒（0、5、10、25、50和100μL/mL ）处理人肝癌细胞（Huh7，HepG2和SK-Hep-1）后，采用CCK-8和克隆形成实验分别检测各组细胞的增值活性和克隆形成能力。构建裸鼠皮下瘤模型，分为实验组（脱醇红酒，300μL/d ）和对照组，干预4周后对比两组肿瘤体积。构建化学诱导小鼠肝癌模型，分为实验组（脱醇红酒，300μL/d ）和对照组，干预6周后对比两组肝脏肿瘤数量、最大肿瘤直径和肝体比。脱醇红酒（75μL/mL ）处理48h 后，利用RNA-seq 对Huh7细胞转录组测序，基因集富集分析（GSEA ）观察基因集及通路的变化；流式细胞术检测脱醇红酒（75μL/mL ）干预后Huh7细胞周期和凋亡变化。结果在体外，脱醇红酒呈浓度和时间依赖性地抑制肝癌细胞的增殖活性，呈浓度依赖性地抑制其克隆形成能力。在体内，相比于对照组，脱醇红酒显著抑制实验组裸鼠皮下瘤的体积（P <0.05），也能显著抑制实验组化学诱导肝癌小鼠的肝脏肿瘤数量（P <0.001）、最大肿瘤直径(P <0.05）和肝体比（P <0.01）。RNA-seq 结果显示，脱醇红酒干预后Huh7细胞内有634个基因上调和478个基因下调（|log2FC|≥2，Q ≤0.05）。基因集富集分析发现，脱醇红酒能够诱导细胞周期通路
相关基因集显著下调（包括E2F Targets 、G2M Checkpoint 、MYC Targets 等）和细胞凋亡通路相关基因集上调；流式细胞检测结果表明，脱醇红酒的干预使Huh7细胞G1期阻滞，同时诱导细胞凋亡。结论脱醇红酒对HCC 的发生发展具有抑制作用，其机制可能与细胞周期和凋亡相关通路介导的肝癌细胞G1期阻滞和细胞凋亡有关。关键词：脱醇红酒；肝细胞癌；多酚；RNA-seq ；细胞周期；细胞凋亡
Abstract:Objective To investigate the inhibitory effect of dealcoholized red wine (DRW)on occurrence and progression of hepatocellular carcinoma (HCC)and explore its possible mechanisms.Methods Three HCC cell lines (Huh7,HepG2and SK-Hep-1)treated with 5,10,25,50and 100μL/mL DRW were examined for changes in proliferation and colony formation ability using CCK-8assay and colony formation assay.A nude mouse model bearing subcutaneous HCC xenograft was used to test the effect of 300μL/day DRW for 4weeks on tumor growth.The inhibitory effect of 300μL/day DRW for 6weeks on tumor growth was also observed in a mouse model of chemically induced HCC by examining the tumor number,largest tumor diameter and the liver/body ratio.RNA-seq technique was used for transcriptome sequencing of Huh7cells treated with DRW (75μL/mL)for 48h,and gene-set enrichment analysis (GSEA)was performed to identify the changes in genes and pathways.Flow cytometry assay was used to analyze the changes in cell cycle and apoptosis of the cells.Results DRW inhibited the proliferation of the HCC cell lines in a concentration-and time-dependent manner,
and concentration-dependently inhibited colony formation of the cells.Treatment with DRW significantly reduced the volume of subcutaneous tumor xenograft in the tumor-bearing nude mice (P <0.05),and lowered the number of tumors (P <0.001),the largest tumor diameter (P <0.05)and the liver/body ratio (P <0.01)in mice with chemically induced HCC.RNA-seq showed that 634genes were significantly up-regulated and 478were down-regulated in Huh7cells after treatment with DRW.Gene-set enrichment analysis revealed that DRW significantly down-regulated cell cycle-related pathways (E2F Targets,G2M Checkpoint and MYC Targets)and up-regulated apoptosis pathways.Flow cytometry assay showed that DRW induced cell cycle arrest in G1phase and apoptosis of Huh7cells.Conclusion DRW inhibits the occurrence and progression of HCC,and this effect is mediated possibly by inducing cell cycle arrest and apoptosis.
Keywords:dealcoholized red wine;hepatocellular carcinoma;polyphenol;RNA-seq;cell cycle;apoptosis
收稿日期：2023-04-14
基金项目：国家自然科学基金（U22A20274）
Supported by National Natural Science Foundation of China (U22A20274).作者简介：兰玉，硕士，E-mail:*********************通信作者：孙剑，博士，主任医师，E-mail:***************
J South Med Univ,2023,43(8):1297-1305doi 10.12122/j.issn.1673-4254.2023.08.05
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红葡萄酒是一种由葡萄酿制发酵而成的酒精饮料，
含有大量活性化合物，同时含有13%左右被认定为一级
致癌物质的酒精［4］
。有证据显示，在2020年全球所有新发癌症病例中，有3.5%与过度饮酒和酗酒有关［5］，但是有流行病学研究表明，适度饮用红酒与肺癌［6］、前列腺癌［7］、结直肠癌［8］、非霍奇金淋巴瘤［9］等癌症的风险降低有关，这可能与红酒中含有的大量多酚类物质的抑癌作用有关［10］。例如，红酒中提取的白藜芦醇［11］、类黄酮［12］、花青素［13］、没食子酸［14］等均已被证实可通过相应机制发挥对HCC 的抑制作用。然而，有研究表明，由于不同多酚之间存在协同作用，相互提高生物利用度和生物效应，多酚混合物的抑癌效果优于单种多酚［15-17］。脱醇红酒作为一种含有多种多酚但不含酒精的饮料，可能具有抑制HCC 发生发展的作用，但是尚无研究报道证实。本研究的目的就是探索脱醇红酒对HCC 发生发展的影响，并通过RNA-seq 探索其可能的机制，为HCC 的预防和
提供新策略。
1材料和方法1.1实验材料
1.1.1细胞和动物所有细胞株包括Huh7，HepG2和SK-Hep-1购自中国科学院细胞库。所有实验动物包括：①BALB/c-Nu 小鼠，4周龄，雄性，体质量15±2g ，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司（动物许可证号：SCXK （湘）2019-0004）；②C57BL/6J 小鼠，2周龄，雄性，体质量8±2g ，购自广东斯嘉景达生物科技有限公司（动物许可证号：SCXK （粤）2020-0052）。所有动物实验均由南方医院实验动物伦理委员会审查通过，并遵从动物实验3R 原则。
1.1.2主要试剂耗材DMEM 、PBS 、胰蛋白酶（Gibco ）；胎牛血清（ThermoFisher ）；Cell Cycle Staining Kit 、Annexin V-FITC/PI kit （Multi Sciences ）；CCK-8试剂盒（MCE ）；二已基亚硝胺、四氯化碳（Sigma ）；橄榄油（阿拉丁）；细胞培养皿、头、注射器等（NEST ）。1.1.3主要仪器二氧化碳细胞培养箱（Labotect ）；光学显微镜（Leica ）；多功能酶标仪（BioTek ）；生物安全柜、水平台式离心机、-80℃超低温冰箱（ThermoFisher ）；真空冷冻干燥机（LaboGene ）；Influx TM 流式细胞分选仪（BD Biosciences ）。1.2实验方法
1.2.1脱醇红酒制备红葡萄酒产自法国波尔多拉菲罗斯柴德酒庄（传奇波尔多红，V ol 13%）。制备方法：第1阶段：将红酒分装至玻璃容器，密封后放入-80℃冰箱过夜使物料冻结；第2阶段：运行真空冷
冻干燥机并预冷，待冷阱温度降至-110℃时进行下一步；第3阶段：将已冻结红酒迅速转移至冷阱中防止其溶化，放入后旋紧气孔，打开真空泵持续抽真空，在真空状态（<100mTorr ）
下冷冻干燥12h 。脱醇脱水结束后密封冷冻保存。实验
时将已脱水脱醇红酒使用含10%血清的DEME 溶液溶解至原体积使用，试剂盒检测脱醇后酒精含量<0.5%。1.2.2细胞培养所有细胞系均使用含有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的DMEM 培养基，在37℃和5%CO 2环境的细胞培养箱中进行培养。
1.2.3CCK-8增殖实验取对数生长期细胞，以2000/孔的细胞密度铺板至96孔板，每孔100μL 培养基。孵箱中培养8h 至细胞贴壁后，分为对照组（Control ）和实验组（DRW ），每组5个重复孔。使用不同浓度脱醇红酒溶液（0、5、10、25、50和100μL/mL ）培养48h ；使用含50μL/mL 脱醇红酒溶液的培养48和96h 。处理结束后，弃掉旧培养基，加入10%CCK-8溶液各100μL ，孵育2h 后使用酶标仪检测450nm 处吸光值（A 值）。细胞增殖抑制率（IR%）=（A 对照组-A 实验组）/A 对照组×100%。1.2.4克隆形成实验取对数生长期细胞，以400个细胞/孔的密度铺板至12孔板培养，待贴壁后加入不同浓度脱醇红酒（0、10、25和50μL/mL ）培养10d 左右。有适当数量克隆形成时，弃掉旧培养基并用PBS 洗涤后，加入4%多聚甲醛固定20min ，再次PBS 洗涤，随后加入0.4%结晶紫染液染20min 。染完成后PBS 洗净染液并晾干，使用相机拍照。使用ImageJ 软件对克隆形成数量进行统计及分析。
1.2.5皮下异种移植肿瘤模型选择4周龄雄性BALB/c-nu 裸鼠18只，饲养于SPF 动物房适应环境2d 。将SK-Hep-1细胞以5×106/只的量接种至裸鼠右腹股沟处，接种时于皮下推注100μL 细胞悬液，随机分为对照组（Control ）和实验组（DRW ），n =9只。实验组每天灌胃给予脱醇红酒300μL ，对照组给予等量生理盐水，连续给药28d ，每周测量肿瘤长径和短径。肿瘤体积=1/2×长径×短径2。
1.2.6化学诱导肝癌模型选择12d 龄雄性C57BL/6J 乳鼠，饲养于SPF 动物房适应环境2d 。第14d 时腹腔注射二乙基亚硝胺（DEN ，25mg/kg ）1次，第4周开始腹腔注射四氯化碳（CCL 4，0.5mL/kg ，溶于橄榄油）每周1次至试验结束。第12周时将小鼠随机分为对照组（n =25）和实验组（DRW ，n =12）并开始干预。实验组每天灌胃给予脱醇红酒300μL ，对照组给与等量生理盐水。干预至第18周时，麻醉后采用颈椎脱臼法将小鼠处死，剖腹取出肝脏，测量并记录肝脏肿瘤数量、最大肿瘤直径和肝脏质量。肝体比=肝脏质量/体质量×100%。1.2.7RNA-seq 取对数生长期的Huh7细胞接种至6孔板，培养至细胞贴壁后，实验组使用60μL/mL 的脱醇红酒溶液处理，对照组不干预，培养48h 。使用Trizol 试剂裂解细胞，以提取总RNA 。委托深圳华大基因股份有限公司使用BGISEQ 平台进行测序服务，使用DESeq2对实验组和对照组进行差异基因表达分析。相关差异
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基因列表已公开至“国家生物信息中心国家生物信息中
法国葡萄酒酒庄心OMIX 多元数据归档库”（ID ：OMIX004295，网址:ngdccb.ac/omix/）。1.2.8基因集富集分析（GSEA ）参照分子标签数据库（MsigDB ）中的HALLMARK 类别的基因集，对经过筛选的差异基因（|log2FC|≥2，Q ≤0.05）采用GSEA 进行基因集富集分析。将与对照组比较出现异常的基因集信号通路按照标准化富集分数（NES ）值降序排列，结果中ES 为富集分数，NES 为标准化后的富集分数，NOM p -val 为名义P 值，是对ES 的统计学分析，FDR p-val 为错误发现率。当NES 绝对值>1，NOM p -val<0.05且FDR q -val<0.25时，其通路下的基因集被认为有意义。1.2.9流式细胞术选择对数生长期细胞接种至6孔板中，使用不同浓度脱醇红酒溶液（0、75和150μL/mL ）培养48h 。分别使用Cell Cycle Staining 试剂盒和Annexin V-FITC/PI 试剂盒处理并收集所得的细胞，操作均按照标准化步骤进行，然后通过流式细胞仪进行检测，细胞
周期分布和细胞凋亡情况使用FlowJo 7.6软件分析。
1.3统计学分析
采用GraphPad Prism 8.0软件进行数据统计分析并绘制图表，采用R 3.6.0进行差异基因筛选，采用G
SEA4.3.2软件进行基因集富集分析。计量数据采用均数±标准差表示，每项实验至少重复3次。两组间比较采用独立样本t 检验，P <0.05认为差异具有统计学意义。2结果
2.1脱醇红酒抑制肝癌细胞的增殖活性
脱醇红酒以剂量和时间依赖的方式抑制Huh7和HepG2的增殖（图1）。脱醇红酒对两种细胞的抑制具有剂量效应，随着剂量升高抑制率逐渐增大，对Huh7和HepG2的IC 50分别为55.81和23.85μL/mL 。在固定浓度（50μL/mL ）下，脱醇红酒对两种细胞的抑制具有时间效应，时间越久，细胞活力越弱。
图1DRW 对肝癌细胞的增殖抑制作用
Fig.1Inhibitory effect on dealcoholized red wine (DRW)on proliferation of HCC cells.A :Inhibition rate and A valve of Huh7cells.B :Inhibition rate and OD valve of HepG2cells.*P <0.05,**P <0.01,***P <0.001vs DRW group.
510
25
50100
DRW (μL/mL)
HepG29080706050403020100
P e r c e n t a g e o f i n h i b i t i o n (%)
**
*
HepG2Control DRW
A 450n m
1.0
0.5
48
96
Treatment time (h)
706050
403020100
P e r c e n t a g e o f i n h i b i t i o n (%)
Huh7
5
10
25
50
100
DRW (μL/mL)
Huh7
48
96
Treatment time (h)
2.01.5
1.00.50
A 450n m
***
**
Control DRW
A
B
2.2脱醇红酒抑制肝癌细胞的克隆形成能力
脱醇红酒以剂量依赖的方式抑制Huh7和SK-Hep-1细胞的克隆形成能力，剂量越高克隆形成数量越少（图2）。Huh7细胞中，实验组（10、25和50μL/mL ）克隆形成数量相较于对照组均减少，其中25和50μL/mL 组
显著减少（P <0.001，图2B ）；SK-Hep-1细胞中，实验组（10、25和50μL/mL ）克隆形成数量相较于对照组均显著减少（P <0.001，图2C ）。
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2.3脱醇红酒抑制裸鼠异种移植肿瘤的生长
脱醇红酒的干预能够抑制裸鼠皮下荷瘤的生长，脱醇红酒组的肿瘤生长速度显著慢于对照组（图3）。
第4周时两组肿瘤大小（图3A ），结果显示实验组肿瘤的体积（646.2±206.5mm 3）显著小于对照组（360.7±
164.3mm 3），差异有统计学意义（P <0.05，图3B ）。
2.4脱醇红酒抑制小鼠化学诱导原发性肝癌的发生发展
本实验采用DEN 联合CCl4诱导小鼠肝癌的发生，造模示意图及两组代表性肝脏肿瘤生长情况（图4A 、B ）。该模型结合了DEN 诱导的DNA 损伤和突变，及
N u m b e r o f c o l o n i e s (n )
6005004003002001000
Huh7
***
***
102550
DRW (μL/mL)
B
图2DRW 对肝癌细胞克隆形成数量的影响
Fig.2Effect of dealcoholized red wine (DRW)on clone formation of HCC cells.A :Gross observation of the colonies.B :Colony number of Huh7cells.C :Colony number of Sk-Hep-1cells.***P <0.001vs Control group.
Huh7
SK-Hep-1
Control 10μL/mL
25μL/mL 50μL/mL
DRW
***
***
***
N u m b e r o f c o l o n i e s (n )
5004003002001000
SK-Hep-1
102550
DRW (μL/mL)
A
C
图3DRW 抑制裸鼠皮下荷瘤的生长
Fig.3Dealcoholized red wine (DRW)inhibits subcutaneous HCC xenograft growth in nude mice.A :General observation of the tumors.B :Tumor growth curve of DRW and Control groups.*P <0.05vs DRW group.
Control
DRW
D R W
C o n t r o l
T u m o r v o l u m e (m m 3)
8007006005004003002001000*
7142128
Post-treated time (d)
B
A
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CCl4介导的炎症和纤维化，最终导致小鼠肝脏肿瘤发
生，与人类HCC 的微环境具有一些共同特征［18］。结果显示，脱醇红酒显著抑制小鼠肝脏肿瘤发生和发展，表现为实验组肝脏肿瘤数目（10.8±3.6）显著少于对
照组（18.2±5.9，P <0.001，图4C ），最大肿瘤直径（4.3±
1.00mm ）显著小于对照组（5.1±0.9mm ，P <0.05，图4D ），肝体比（4.9±0.38）也显著低于Control 组（5.45±0.48，P <0.01，图4E ）
。
Control
DRW
T u m o r n u m b e r (n )
***
302520151050
Control
DRW *
Control
DRW
L a r g e t s t u m o r d i a m e t e r (m m )
76543210
**
Control DRW
L i v e r b o d y r a t i o (%)
7654321
A
B
C
D
E
图4DRW 抑制化学诱导小鼠肝癌的发生发展
Fig.4DRW inhibits occurrence and progression of chemically induced HCC in mice.A :Experimental design of
DEN/CCL4-induced mouse model.B :General view of HCC in the two groups.C -E :Tumor number,largest tumor diameter and liver/body ratio in the control group (n =25)and DRW group (n =12).*P <0.05,**P <0.01,***P <0.001.
2.5脱醇红酒对Huh7细胞转录组及通路的影响
对Huh7细胞进行RNA-seq 共得到1112个显著差异基因（|log2FC|≥2，Q ≤0.05），其中实验组上调478个，下调634个。基因集富集分析结果显示，脱醇红酒干预使细胞周期相关通路（包括E2F TARGETS 、G2M CHECKPOINT 和MYC TARGETS 等基因集）显著下调（表1），细胞凋亡通路（Apoptosis ）显著上调（表2）。 2.6脱醇红酒诱导Huh7细胞周期G1期阻滞和细胞凋亡
流式细胞术结果显示，脱醇红酒能够诱导Huh7细胞的G1期阻滞，75μL/mL 和150μL/mL 组的G1期细胞占比[（60.5±0.63）%和（63.9±0.58）%]相比于对照组[（45.5±0.62）%]显著增加（P <0.001，图5C ）；同时脱醇红酒也能够诱导细胞凋亡，75μL/mL 和150μL/mL 组凋亡率[（46.5±1.4）%和（50.6±2.5）%]相比于对照组[（2.7±0.1）%]显著增加（P <0.001，图5D ）
。
表1DRW 组下调信号通路
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